PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

2.4.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study) dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm của Nguyễn Như Thanh (2001) [55], Nguyễn Văn Thiện (1997) [56].

Chúng tôi dùng phương pháp nghiên cứu cắt ngang tìm căn nguyên của bệnh. So sánh tần suất của hội chứng tiêu chảy giữa các nhóm khác nhau. Các cá thể trong cùng nhóm, cũng như các yếu tố nguy cơ, các thông tin khác đều được tiến hành trong cùng thời điểm nghiên cứu.

* Chọn mẫu điều tra:

Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc. Chọn ngẫu nhiên mỗi huyện 3 xã, mỗi xã ngẫu nhiên chọn 3 thôn; trong thôn điều tra các hộ chăn nuôi thỏ.

- Số huyện được điều tra: 3; số xã, Thị Trấn là: 9; số thôn, khu là: 27 - Số lần điều tra: 4 lần theo các mùa (mùa thu, mùa đông trong năm 2010; mùa xuân, mùa hè trong năm 2011).

* Phương pháp:

- Trực tiếp quan sát để phát hiện thỏ tiêu chảy. Những thỏ phân lỏng được coi là bị tiêu chảy.

- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết. - Thông tin điều tra được ghi vào các phiếu điều tra

* Nội dung điều tra, theo dõi:

- Số thỏ mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại các hộ, các trang trại chăn nuôi.

- Các triệu chứng thường gặp ở thỏ mắc tiêu chảy.

- Các triệu chứng, bệnh tích ở thỏ mắc tiêu chảy khi tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Phương thức chăn nuôi và việc thực hiện vệ sinh chuồng trại.

* Các phương pháp đo lường trong dịch tễ:

- Tỷ lệ thỏ mắc tiêu chảy (%) = Số thỏ tiêu chảy

x 100 Tổng số thỏ điều tra

- Tỷ lệ tiêu chảy theo độ tuổi (%) =

Số thỏ tiêu chảy theo độ tuổi

x 100 Tổng số thỏ theo độ tuổi

được điều tra

- Tỷ lệ chết do tiêu chảy (%) = Số thỏ chết do tiêu chảy

x 100 Tổng số thỏ mắc tiêu chảy

* Phương pháp phân tích dịch tễ:

Để so sánh nguy cơ mắc bệnh tiêu chảy và chết do bệnh tiêu chảy ở thỏ theo lứa tuổi, mùa vụ, phương thức chăn nuôi, chúng tôi dùng chỉ tiêu nguy cơ tương đối (Relative Risk – RR).

Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [55] nguy cơ tương đối, biểu thị bằng các nguy cơ so sánh và được định nghĩa là nguy cơ phát triển một bệnh trong số các cá thể có cảm nhiễm (có tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ nghi ngờ, được so sánh với nguy cơ phát triển bệnh đó, trong số các cá thể không cảm nhiễm (không tiếp xúc) với yếu tố nguy cơ đó.

Để so sánh một yếu tố nguy cơ với các nhóm bệnh và nhóm đối chứng liệu dịch tễ học được thể hiện ở bảng sau:

Khai thác sau khi chọn

Chủ động chọn vào nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Bệnh trạng

Cộng

Có Không

Cảm nhiễm khi tiếp xúc với nguy cơ

Có A B a + b

Không C D c + d

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Trong đó:

a: Số gia súc được chọn là có bệnh, có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ. b: Số gia súc không có bệnh, nhưng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ. c: Số gia súc có bệnh nhưng không có tiếp xúc.

d: Số gia súc không có bệnh và cũng không có tiếp xúc. Nguy cơ tương đối được tính theo công thức sau:

/( ) /( ) Ie a a b RR Io c c d     Trong đó:

Ielà tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm có cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ.

Io là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm không cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ. Đánh giá kết quả:

+ Nếu RR > 1 nói lên sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ, trị số RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh.

+ RR = 1 nói lên bệnh và cảm nhiễm không có liên quan gì đến nhau. + RR < 1 nói lên một kết hợp âm tính

* Dùng khi bình phương ( 2

)so sánh tần suất bệnh:

Bằng công thức của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002) [57]:

2 2 ( ) ( ) ( )( )( )( ) TN ad bc a b c d a b c d a c b d          

Các số liệu áp dụng trong nguy cơ tương đối

Tìm giá trị 2ứng với độ tự do v(111)(12 1) (2 1)(2 1)  1

Ta tìm được các giá trị 2=3,8; 6,6; 10,8 với mức  = 0,05; 0,01; 0,001 bằng cách tra bảng.

So sánh 2

TN

 với 2để tìm xác suất xuất hiện các giá trị 2

TN

 hoàn toàn do ngẫu nhiên sinh ra.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Đánh giá kết quả: Nếu 2 2

TN

  tức P > 0,05 thì kết quả không có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ. Nếu 2 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

TN

  tức P < 0,05 thì kết luận có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ ở mức .

2.4.2. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn

* Thu thập mẫu:

- Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng thỏ mắc tiêu chảy chưa dùng thuốc (kháng sinh) điều trị. Khi toàn bộ tăm bông thấm ướt phân thỏ, lấy ra, cho ngay vào tuýp, vặn chặt và ghi ký hiệu mẫu. Sau đó, cho vào bảo quản lạnh 2 – 40

C trong thùng bảo ôn.

- Mẫu chất chứa đếm số lượng vi khuẩn: Mỗi con thỏ lấy 3 – 6 mẫu ở các vị trí khác nhau của ruột, mỗi mẫu là 1 gram chất chứa ở trong ruột thỏ ngay khi vừa mổ khám.

- Mẫu bệnh phẩm gồm: Máu tim, lách, gan, hạch ruột, chất chứa ruột non, ruột già của thỏ tiêu chảy.

- Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh 40C, theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.

* Phân lập và giám định vi khuẩn:

Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy.

Mẫu là phủ tạng, phân hoặc chất chứa trong ruột của thỏ có triệu chứng tiêu chảy được ria cấy lên các môi trường thạch máu, thạch MacConkey và thạch DHL bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Trên các đĩa thạch sau 18 – 24 giờ nuôi cấy 370C có thể quan sát thấy các dạng khuẩn lạc như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

TT Loại vi khuẩn

Màu sắc và hình thái khuẩn lạc trên các loại môi trƣờng sau khi nuôi cấy ở 370

C/ 24h

Thạch máu Thạch

MacConkey Thạch DHL

1 E. coli Trắng đục, gọn, dung

huyết hoặc không Đỏ, không nhày Hồng cánh sen

2 Salmonella spp Trắng đục, gọn,

không dung huyết Trắng đục Đen, tròn, gọn

3 Proteus Mọc lan tràn Trắng 4 Enterobacter aerogenes Trắng đục, tròn Hồng, nhày 5 Enterococcus faecalis Trong, nhỏ, dung huyết hoặc không dung huyết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 1: Sơ đồ quy trình phân lập và xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli

Thạch máu, tủ ấm 37oC/24-48h

Bệnh phẩm

(Phân, phủ tạng của thỏ bị tiêu chảy)

Thạch MacConkey, tủ ấm 37oC/24-48h

Chọn khuẩn lạc nghi là vi khuẩn E. coli (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Thạch Máu, Thạch MacConkey tủ ấm 37o

C/24-48h (để tạo giống thuần)

Kiểm tra đặc tính sinh hóa - Sinh Indol

- Lên men đường - Di động

- H2S...

Giữ giống

Xác định khả năng mẫn cảm với kháng

sinh của E. coli

Xác định serotype bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Xác định các yếu

tố gây bệnh Xác định độc lực Kiểm tra hình thái

vi khuẩn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

(Phòng vi trùng – Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương)

Căn cứ vào màu sắc, hình dạng khuẩn lạc trên các môi trường mà có thể xác định và phân loại vi khuẩn đường ruột. Những khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E. coli được phiết kính kiểm tra hình thái và tiến hành giám định bằng các đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn. Xác định là thuần khiết thì dùng trong việc xác định serotype và giữ giống để tiến hành các thí nghiệm khác.

2.4.3. Xác định số lƣợng vi khuẩn E. coli trong 1 gam phân thỏ tiêu chảy

và thỏ bình thƣờng

Mẫu là 1g phân thỏ bị tiêu chảy hoặc thỏ bình thường, được pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1

, 10-2, …., 10-8. Lấy 0,1ml dung dịch ở các nồng độ đã pha loãng 10-6

, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn đều trên bề mặt thạch MacConkey, thạch DHL, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Mỗi nồng độ pha loãng, dùng 3 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc E. coli mọc trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ.

Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức: X = 10 x a x b

Trong đó: X là tổng số lượng vi khuẩn có trong 1 gam phân hoặc 1 gam chất chứa đường ruột.

a: là số lượng khuẩn lạc trung bình của 1 nồng độ pha loãng. b: là hệ số pha loãng mẫu.

Hệ số 10: vì cấy 0,1ml.

2.4.4. Phƣơng pháp xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc

Được thực hiện theo phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính; các chủng vi khuẩn được tiến hành xác định nhóm với các huyết thanh đa giá trước, sau đó đến các huyết thanh đơn giá trong nhóm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Chuẩn bị:

+ Chủng vi khuẩn E. coli cần xác định serotype được cấy trên thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 370

C trong 18 – 24 giờ.

+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá) do hãng Denka, Seiken Co., Ltd, Niigata, Nhật cung cấp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

+ Nước muối sinh lý 0.85%, phiến kính sạch, que cấy.

- Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau:

Nhỏ lên phiến kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng, lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định đã được nuôi trên môi trường thạch máu, trộn đều với 2 giọt nước muối sinh lý để tạo thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (đối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết, sẽ xuất hiện trong vòng 30 giây. Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++. Phản ứng là âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều như bên đối chứng.

Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng serotype. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.4.5. Phƣơng pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

E. coli phân lập đƣợc

* Phương pháp xác định khả năng dung huyết của các chủng vi khuẩn phân lập được:

Vi khuẩn E. coli được cấy trực tiếp lên thạch máu cừu, bồi dưỡng 370C trong 24 giờ, sau đó để ra ngoài điều kiện thường của phòng thí nghiệm khoảng 2 đến 3 giờ để dung huyết diễn ra hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm của dung huyết làm cơ sở để đánh giá các dạng dung huyết , , .

Dung huyết  là dạng dung huyết mờ, không hoàn toàn. Dung huyết  là dạng dung huyết trong hoàn toàn. Dung huyết  hay còn gọi là không dung huyết.

* Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).

Các phương pháp PCR dùng để xác định một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn được thực hiện với một số cải tiến về phương pháp và quy trình thực hiện phản ứng. Có thể tóm tắt như sau:

- ADN đích: Là một lượng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xác định đã được nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 370

C trong vòng 18 đến 24 giờ.

- Các chủng vi khuẩn E. coli chuẩn quốc tế, dùng làm đối chứng dương (đã được kiểm định chắc chắn có mang các gen quy định các yếu tố độc lực) hoặc đối chứng âm (không mang gen sinh yếu tố độc lực), bao gồm: K514/ pLN301 (Iss), NCCB 1395 (CvaC), BM2 – 1 (Cnf1), 711 vir (Cnf2), FD635 (eae), FD636 (Stx1), FD636 (Stx2) và FD527 (đối chứng âm).

- Các cặp mồi cho phản ứng PCR: Do hãng Life Technologies (Gibco, BRL) sản xuất và được bảo quản ở nhiệt độ - 200C. Thứ tự chuỗi ADN của các cặp mồi được trình bày ở bảng 2.1.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.1. Ký hiệu chuỗi ADN của các cặp mồi dùng để xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn APEC và kích cỡ của các sản phẩm sau quá trình điện di

Gen đích

Ký hiệu

primers Thứ tự chuỗi AND Kích cỡ sản phẩm (bP) Yếu tố độc lực cần xác định FimA FimA – F

FimA – R

5’- GTT GAT CAAGTT CAG - 3’

5’- AAT AAC GCG CCT GGA ACG - 3’ 331 F1 Fimbriae (protein chính) FimH FimH – F

FimH – R

5’- TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG - 3’

5’- GCA GTC ACC TGC CCT CCG TGG - 3’ 508

F1 Fimbriae (tiêu chuẩn bám dính)

eae eae – F eae – R

5’- ACG TTG CAG CAT GGG TAA CT - 3’ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

5’- GAT CGG CAA CAG TTT CAC CTG - 3’ 816

Protein Intimin (bám dính và xâm nhập)

PapC PapC– F PapC– R

5’- GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G - 3’

5’- ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A - 3’ 328 P – Fimbriae operon IutA IutA– F

IutA– R

5’- GGC TGG ACA TGG GAA CTG G - 3’

5’- CGT CGG GAA CGG GTA GAA TCG - 3’ 300 Điểm tiếp nhận aerobactin IucA IucA– F

IucA– R

5’- ATT ATG ATC CTG CCC TCT GA - 3’

5’- ATC GCG GCT GGT AGC ACA GTA GA - 3’ 821 Tổng hợp aerobactin Tsh Tsh– F

Tsh– R

5’- AAG TCT GTC AGA CGT CTG TGT T - 3’

5’- GGA TAG CGC TCC TTA TCC AGA T - 3’ 478

Ngưng kết hồng cầu tố mẫn cảm nhiệt độ

Iss Iss– F Iss– R

5’- GTG GCG AAA ACT AGT AAA ACA GC - 3’

5’- CGC CTC GGG GTG GAT AA - 3’ 760

Tăng khả năng sống trong huyết thanh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

CvaC CvaC– F CvaC– R

5’- TAT GAG AAC TCT GAC TCT AAA T- 3’

5’- ATT TAT AAA CAA ACA TCA CTA A - 3’ 559 Gen cấu trúc của protein Stx1 Stx1– F

Stx1– R

5’- CAG TTA ATG TGG TGG CGA AG - 3’

5’- CTG CTA ATA GTT CTG CGC ATG - 3’ 894 Độc tố Shiga 1 Stx2 Stx2– F

Stx2– R

5’- CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG - 3’

5’- GGA TGC ATC TCT GGT CAT TG -3’ 481 Độc tố Shiga 2

Cnf1 Cnf1– F Cnf1– R (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

5’- AGG AAG TTA TAT TTC CGT AGG - 3’

5’- GTA TTT GCC TGA ACC GTA A - 3’ 498

Yếu tố gây độc và hoại tử tế bào loại 1

Cnf2 Cnf2 F Cnf2 R

5’- AAT CTA ATT AAA GAG AAC - 3’

5’- CAT GCT TTG TAT ATC TA - 3’ 543

Yếu tố gây độc và hoại tử tế bào loại 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Phản ứng PCR: Hỗn hợp phản ứng (25l) gồm 2,5l 10 x PCR buffer