3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.2. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn
* Thu thập mẫu:
- Mẫu phân phân lập vi khuẩn: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng thỏ mắc tiêu chảy chưa dùng thuốc (kháng sinh) điều trị. Khi toàn bộ tăm bông thấm ướt phân thỏ, lấy ra, cho ngay vào tuýp, vặn chặt và ghi ký hiệu mẫu. Sau đó, cho vào bảo quản lạnh 2 – 40
C trong thùng bảo ôn.
- Mẫu chất chứa đếm số lượng vi khuẩn: Mỗi con thỏ lấy 3 – 6 mẫu ở các vị trí khác nhau của ruột, mỗi mẫu là 1 gram chất chứa ở trong ruột thỏ ngay khi vừa mổ khám.
- Mẫu bệnh phẩm gồm: Máu tim, lách, gan, hạch ruột, chất chứa ruột non, ruột già của thỏ tiêu chảy.
- Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh 40C, theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y và được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
* Phân lập và giám định vi khuẩn:
Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy.
Mẫu là phủ tạng, phân hoặc chất chứa trong ruột của thỏ có triệu chứng tiêu chảy được ria cấy lên các môi trường thạch máu, thạch MacConkey và thạch DHL bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Trên các đĩa thạch sau 18 – 24 giờ nuôi cấy 370C có thể quan sát thấy các dạng khuẩn lạc như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TT Loại vi khuẩn
Màu sắc và hình thái khuẩn lạc trên các loại môi trƣờng sau khi nuôi cấy ở 370
C/ 24h
Thạch máu Thạch
MacConkey Thạch DHL
1 E. coli Trắng đục, gọn, dung
huyết hoặc không Đỏ, không nhày Hồng cánh sen
2 Salmonella spp Trắng đục, gọn,
không dung huyết Trắng đục Đen, tròn, gọn
3 Proteus Mọc lan tràn Trắng 4 Enterobacter aerogenes Trắng đục, tròn Hồng, nhày 5 Enterococcus faecalis Trong, nhỏ, dung huyết hoặc không dung huyết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 1: Sơ đồ quy trình phân lập và xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli
Thạch máu, tủ ấm 37oC/24-48h
Bệnh phẩm
(Phân, phủ tạng của thỏ bị tiêu chảy)
Thạch MacConkey, tủ ấm 37oC/24-48h
Chọn khuẩn lạc nghi là vi khuẩn E. coli
Thạch Máu, Thạch MacConkey tủ ấm 37o
C/24-48h (để tạo giống thuần)
Kiểm tra đặc tính sinh hóa - Sinh Indol
- Lên men đường - Di động
- H2S...
Giữ giống
Xác định khả năng mẫn cảm với kháng
sinh của E. coli
Xác định serotype bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Xác định các yếu
tố gây bệnh Xác định độc lực Kiểm tra hình thái
vi khuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(Phòng vi trùng – Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương)
Căn cứ vào màu sắc, hình dạng khuẩn lạc trên các môi trường mà có thể xác định và phân loại vi khuẩn đường ruột. Những khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E. coli được phiết kính kiểm tra hình thái và tiến hành giám định bằng các đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn. Xác định là thuần khiết thì dùng trong việc xác định serotype và giữ giống để tiến hành các thí nghiệm khác.
2.4.3. Xác định số lƣợng vi khuẩn E. coli trong 1 gam phân thỏ tiêu chảy
và thỏ bình thƣờng
Mẫu là 1g phân thỏ bị tiêu chảy hoặc thỏ bình thường, được pha loãng trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1
, 10-2, …., 10-8. Lấy 0,1ml dung dịch ở các nồng độ đã pha loãng 10-6
, 10-7, 10-8 nhỏ và dàn đều trên bề mặt thạch MacConkey, thạch DHL, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Mỗi nồng độ pha loãng, dùng 3 đĩa thạch. Đếm số khuẩn lạc E. coli mọc trên đĩa thạch, rồi tính trung bình cho mỗi nồng độ.
Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức: X = 10 x a x b
Trong đó: X là tổng số lượng vi khuẩn có trong 1 gam phân hoặc 1 gam chất chứa đường ruột.
a: là số lượng khuẩn lạc trung bình của 1 nồng độ pha loãng. b: là hệ số pha loãng mẫu.
Hệ số 10: vì cấy 0,1ml.
2.4.4. Phƣơng pháp xác định serotype kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
Được thực hiện theo phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính; các chủng vi khuẩn được tiến hành xác định nhóm với các huyết thanh đa giá trước, sau đó đến các huyết thanh đơn giá trong nhóm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Chuẩn bị:
+ Chủng vi khuẩn E. coli cần xác định serotype được cấy trên thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 370
C trong 18 – 24 giờ.
+ Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá) do hãng Denka, Seiken Co., Ltd, Niigata, Nhật cung cấp.
+ Nước muối sinh lý 0.85%, phiến kính sạch, que cấy.
- Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính như sau:
Nhỏ lên phiến kính sạch, mỗi đầu một giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng, lấy khuẩn lạc E. coli cần xác định đã được nuôi trên môi trường thạch máu, trộn đều với 2 giọt nước muối sinh lý để tạo thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyễn dịch và một giọt nước sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (đối chứng). Nếu có phản ứng ngưng kết, sẽ xuất hiện trong vòng 30 giây. Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì được đánh giá mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết để có thể đánh giá mức ngưng kết ở các mức độ khác nhau +, ++, +++. Phản ứng là âm tính khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng huyết thanh đục đều như bên đối chứng.
Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm để xác định rõ từng serotype. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.5. Phƣơng pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn
E. coli phân lập đƣợc
* Phương pháp xác định khả năng dung huyết của các chủng vi khuẩn phân lập được:
Vi khuẩn E. coli được cấy trực tiếp lên thạch máu cừu, bồi dưỡng 370C trong 24 giờ, sau đó để ra ngoài điều kiện thường của phòng thí nghiệm khoảng 2 đến 3 giờ để dung huyết diễn ra hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm của dung huyết làm cơ sở để đánh giá các dạng dung huyết , , .
Dung huyết là dạng dung huyết mờ, không hoàn toàn. Dung huyết là dạng dung huyết trong hoàn toàn. Dung huyết hay còn gọi là không dung huyết.
* Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).
Các phương pháp PCR dùng để xác định một số yếu tố độc lực cơ bản của vi khuẩn được thực hiện với một số cải tiến về phương pháp và quy trình thực hiện phản ứng. Có thể tóm tắt như sau:
- ADN đích: Là một lượng nhỏ khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần xác định đã được nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 370
C trong vòng 18 đến 24 giờ.
- Các chủng vi khuẩn E. coli chuẩn quốc tế, dùng làm đối chứng dương (đã được kiểm định chắc chắn có mang các gen quy định các yếu tố độc lực) hoặc đối chứng âm (không mang gen sinh yếu tố độc lực), bao gồm: K514/ pLN301 (Iss), NCCB 1395 (CvaC), BM2 – 1 (Cnf1), 711 vir (Cnf2), FD635 (eae), FD636 (Stx1), FD636 (Stx2) và FD527 (đối chứng âm).
- Các cặp mồi cho phản ứng PCR: Do hãng Life Technologies (Gibco, BRL) sản xuất và được bảo quản ở nhiệt độ - 200C. Thứ tự chuỗi ADN của các cặp mồi được trình bày ở bảng 2.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1. Ký hiệu chuỗi ADN của các cặp mồi dùng để xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn APEC và kích cỡ của các sản phẩm sau quá trình điện di
Gen đích
Ký hiệu
primers Thứ tự chuỗi AND Kích cỡ sản phẩm (bP) Yếu tố độc lực cần xác định FimA FimA – F
FimA – R
5’- GTT GAT CAAGTT CAG - 3’
5’- AAT AAC GCG CCT GGA ACG - 3’ 331 F1 Fimbriae (protein chính) FimH FimH – F
FimH – R
5’- TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG - 3’
5’- GCA GTC ACC TGC CCT CCG TGG - 3’ 508
F1 Fimbriae (tiêu chuẩn bám dính)
eae eae – F eae – R
5’- ACG TTG CAG CAT GGG TAA CT - 3’
5’- GAT CGG CAA CAG TTT CAC CTG - 3’ 816
Protein Intimin (bám dính và xâm nhập)
PapC PapC– F PapC– R
5’- GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G - 3’
5’- ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A - 3’ 328 P – Fimbriae operon IutA IutA– F
IutA– R
5’- GGC TGG ACA TGG GAA CTG G - 3’
5’- CGT CGG GAA CGG GTA GAA TCG - 3’ 300 Điểm tiếp nhận aerobactin IucA IucA– F
IucA– R
5’- ATT ATG ATC CTG CCC TCT GA - 3’
5’- ATC GCG GCT GGT AGC ACA GTA GA - 3’ 821 Tổng hợp aerobactin Tsh Tsh– F
Tsh– R
5’- AAG TCT GTC AGA CGT CTG TGT T - 3’
5’- GGA TAG CGC TCC TTA TCC AGA T - 3’ 478
Ngưng kết hồng cầu tố mẫn cảm nhiệt độ
Iss Iss– F Iss– R
5’- GTG GCG AAA ACT AGT AAA ACA GC - 3’
5’- CGC CTC GGG GTG GAT AA - 3’ 760
Tăng khả năng sống trong huyết thanh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CvaC CvaC– F CvaC– R
5’- TAT GAG AAC TCT GAC TCT AAA T- 3’
5’- ATT TAT AAA CAA ACA TCA CTA A - 3’ 559 Gen cấu trúc của protein Stx1 Stx1– F
Stx1– R
5’- CAG TTA ATG TGG TGG CGA AG - 3’
5’- CTG CTA ATA GTT CTG CGC ATG - 3’ 894 Độc tố Shiga 1 Stx2 Stx2– F
Stx2– R
5’- CTT CGG TAT CCT ATT CCC GG - 3’
5’- GGA TGC ATC TCT GGT CAT TG -3’ 481 Độc tố Shiga 2
Cnf1 Cnf1– F Cnf1– R
5’- AGG AAG TTA TAT TTC CGT AGG - 3’
5’- GTA TTT GCC TGA ACC GTA A - 3’ 498
Yếu tố gây độc và hoại tử tế bào loại 1
Cnf2 Cnf2 F Cnf2 R
5’- AAT CTA ATT AAA GAG AAC - 3’
5’- CAT GCT TTG TAT ATC TA - 3’ 543
Yếu tố gây độc và hoại tử tế bào loại 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Phản ứng PCR: Hỗn hợp phản ứng (25l) gồm 2,5l 10 x PCR buffer (750mM Tris-HCl (pH 8,8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) Tween20); 2mM MgCl2; 200M dNTP mỗi loại (dATP, dCTP,dGTP and dCTP) (Life Technologies), 1l primer (3,2M/l); 0,25 U Taq DNA polymerase (Advanced Biotechnologies), ADN của chủng vi khuẩn cần kiểm tra (lấy trực tiếp từ khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch máu) và nước cất (Gibco, BRL) vừa đủ 25l.
- Phản ứng PCR được tiến hành trong máy nhân gen (Mastercycler, Eppendorf) theo các chu trình như sau: 940
C/5 phút (1 chu kỳ); 940C/1 phút, Tm/1 phút, 720C/1 phút (30 chu kỳ); 720C/7 phút, trong đó Tm là nhiệt độ tan chảy thích hợp của mỗi loại primer.
- Điện di: các sản phẩm HNA thu được sau quá trình PCR được tiến hành chạy điện di trên thạch agarose 2% (Gibco, BRL) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Nhuộm với TAE có bổ sung Ethidium bromide trong 15 phút. Các sản phẩm được quan sát dưới đèn UV (300nm), dùng hệ thống Gel Doc 2000 (Bio – Rad). Ảnh được lưu giữ lại và được tiến hành xử lý kết quả khi cần thiết.
2.4.6. Phƣơng pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli
Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh được thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Các chủng vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy vào môi trường BHI trong bình tam giác 100 ml sau đó canh trùng được bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ, trong quá trình nuôi có lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột bạch khỏe mạnh, khối lượng từ 18 - 20 g/con, với liều 0,2 ml/chuột, tiêm xoang phúc mạc. Trong thí nghiệm, mỗi lô chuột để 2 con tiêm dung dịch BHI làm đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bước 3: Cho chuột ăn, uống bình thường và theo dõi những biểu hiện, triệu chứng phản ứng sau tiêm. Kiểm tra và đánh giá số chuột tới 7 ngày.
Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn .
Bước 4: Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng, mổ khám kiểm tra sự biến đổi của các cơ quan nội tạng, sau đó tiến hành nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm (máu tim) của chuột chết.
2.4.7. Phƣơng pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đƣợc
- Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (NCCLS) (1999) [88].
- Phương pháp tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hiton
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn E. coli được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C. Lấy 1/2 khuẩn lạc, hòa vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy so màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxioid (Anh) lên mặt đĩa thạch.
+ Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 370
C/ 18 – 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E. coli kiểm tra. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh được trình bày ở bảng 2.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.2. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS (1999) Kháng sinh Vòng vô khuẩn (đƣờng kính mm) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Trimthoprim-Sulphamethoxazole 10 11 – 15 16 Streptomycin 11 12 – 14 15 Gentamicin 12 13 – 17 18 Neomycin 12 13 – 14 15 Cephalothin 14 15 – 17 18 Amikacin 14 15 – 16 17 Apramycin 10 11 – 14 15 Ceftiofur 17 18 – 20 21 Linco-Spectinomycin 10 11 – 13 14 Enrofloxacin (Batril) 16 17 – 19 20 Ampicillin 11 12 – 14 15 Tetracyclin 14 15 – 18 19 Flumequine ≤ 10 11 – 13 ≥ 14 Amoxycillin ≤ 11 12 – 15 ≥ 16
2.4.8. Xây dựng phác đồ điều trị tiêu chảy ở thỏ
Qua xác định sự mẫn cảm của các vi khuẩn gây bệnh phân lập được với các kháng sinh, hóa dược bằng phương pháp kháng sinh đồ trên thạch, trên cơ sở đó lựa chọn phác đồ điều trị bệnh thích hợp. Để đánh giá được hiệu quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
một cách khách quan, các phác đồ được thực hiện có sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:
- Số thỏ được nuôi ở cùng một địa phương được phân ra ngẫu nhiên làm 3 lô tương ứng với 3 phác đồ điều trị bệnh.