Ethoxyquin có tên thương mại là Santoquin, santoflex hay EQ. Ethoxyquin là một chất chống oxy hóa được FDA chấp thuận và đã cho phép được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi hơn 30 năm qua.
IV.1. Công thức cấu tạo và một số tính chất của Ethoxyquin [9], [16]
Công thức cấu tạo:
6-ethoxy-1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinoline Hay 1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinolin-6-yl ethyl ether
CTPT: C14H19NO
Khối lượng phân tử: 217,31
Trạng thái: chất lỏng màu hơi nâu, nhớt.
Nhiệt độ sôi: 150oC ở 747 mmHg.
Áp suất bay hơi: 3,46.10-2 Pa ở 25oC 1,18.10-1 Pa ở 35oC 3,32.10-1 Pa ở 45oC
Độ thủy phân ở 25oC: pH=5 thời gian bán hủy là 3,7 ngày pH=7 thời gian bán hủy là 6,7 ngày pH=9 thời gian bán hủy là 9,3 ngày
Độ tan (25oC): nước 170mg/l acetonitrile 462 g/l n-octanol 452g/l
IV.2. Ứng dụng và ảnh hưởng của Ethoxyquin [10], [18]
Ethoxyquin được phát hiện vào thập niên 50 bởi Monsanto, ethoxyquin được sử dụng như một loại chống oxi hóa chất béo, chất bảo quản (E324) trong thức ăn chăn ni nhằm tăng tính ổn định các vitamin tan trong dầu, đảm bảo chất lượng của thức ăn chăn ni. Ethoxyquin có hoạt tính giúp các sản phẩm trái cây sau thu hoạch hạn chế quá trình mất mát hàm lượng carotenoid và vitamin E. Ngồi ra, ethoxyquin cịn được sử dụng với mục đích bảo quản màu trong sản xuất bột ớt, chất ổn định chống phân hủy trong sản xuất cao su.
20
Bên cạnh tác dụng bảo quản, ethoxyquin được đăng ký sử dụng như một loại thuốc trừ sâu nhằm tránh sự chuyển màu không mong muốn (thường bị chuyển sang màu nâu) đối với trái cây táo và lê, bằng cách phun trực tiếp trước và sau khi thu hoạch.
Gần đây, tại Nhật Bản có một vài nghiên cứu cho thấy ethoxyquin có khả năng thúc đẩy ung thư thận, ung thư bàng quang và làm tăng lên đáng kể các khối u dạ dày ở vật nuôi. Tuy nhiên, hiện nay chưa có bằng chứng cụ thể nào được ghi nhận trên thế giới về khả năng gây ung thư của Ethoxyquin.
IV.3. Giới hạn cho phép [16], [17]
Hiện nay, tùy theo mục đích sử dụng Ethoxyquin trong thức ăn chăn nuôi hay trong thực phẩm mà mức quy định liều lượng khác nhau.
Tên khu vực/
quốc gia Tên nền mẫu Hàm lượng cho phép
EU
Thức ăn chăn nuôi 150ppm
Các sản phẩm thực vật, động vật trên
cạn, lưỡng cư, bò sát 0,05ppm
Thủy sản 0,1ppm
Hoa Kỳ Thức ăn chăn nuôi 150ppm
Nhật Bản Thức ăn cho tôm 150ppm
Các sản phẩm giáp xác như: tôm, cua,... 0,01ppm
Hàn Quốc Tôm 0,01ppm
Bảng 2. Giới hạn cho phép của ethoxyquin trong một số thực phẩm
IV.4. Một số nghiên cứu về ethoxyquin [9], [15] [16]
IV.4.1. Nghiên cứu trên động vật
Năm 1969, Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hiệp Quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã cùng ban hành 2 bản báo cáo (số hiệu FAO/ PL:1969/M/17/1 và WHO/Food Add./70.38) về “Thẩm định một số dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm”. Trong đó, tại Chương 159 nói về nghiên cứu ethoxyquin,
nhiều thí nghiệm đã được phân tích rất rõ.
Theo đó, các nghiên cứu trên chuột và chó cho thấy có xuất hiện tác dụng độc hại trên gan và thận ở nồng độ ethoxyquin trong thức ăn từ 250 ppm trở lên đối với
21
chuột, và từ 10 ppm đối với chó. Ở nồng độ thấp (khoảng 50 ppm), ethoxyquin nhanh chóng bị chó, chuột và gà bài tiết. Ethoxyquin dễ chuyển hóa thành chất hịa tan và nếu q trình bài tiết xảy ra thuận lợi, ít có khả năng ethoxyquin lưu lại trong cơ thể.
Trong một nghiên cứu khác vào tháng 3/2003, Câu lạc bộ Chuột ở Mỹ (Rat &
Mouse Club of America – RMCA) đã chỉ ra một số đặc tính kháng ung thư của ethoxyquin. Ethoxyquin trong thức ăn của chuột được cho là có thể ngăn ngừa ung thư gan do độc tố aflatoxin gây ra. Aflatoxin là chất gây ung thư tự nhiên phổ biến trong thực phẩm, nhất là trong ngô và các loại hạt. Chuột là loài dễ bị ung thư nhất do ảnh hưởng của aflatoxin. Ngoài ra, ethoxyquin trong thức ăn của chuột cũng được cho là yếu tố góp phần ngăn cản sự tiến triển của các khối u ở vú.
Theo TS. W. Jean Dodds, Chủ tịch Trung tâm Thú y Hemopet (Mỹ), ở động vật trong phịng thí nghiệm, ethoxiquin làm tăng vitamin gan A từ 2-5 lần, trong thức ăn chăn nuôi với hàm lượng cao hơn, chúng làm tăng nồng độ vitamin E trong máu lên 2 lần. Ethoxyquin được đánh giá là độc tính cấp 3, hay nhóm độc tính trung bình. Nếu nhiễm phải với nồng độ từ 0,5 – 5g/kg có thể gây tử vong ở người.
IV.4.2. Nghiên cứu trên thực vật
Ethoxyquin được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu dùng cho một số loại trái cây như lê, táo,...Sau đây là một số chất chuyển hóa từ ethoxyquin. (Mũi tên đứt đoạn chỉ quá trình trao đổi chất cho các sản phẩm chưa được cô lập hoặc chưa được xác định chắc chắn. )
22
Hình 9. Các chất chuyển hóa của ethoxyquin ở lê.
V. Các phương pháp xác định hàm lượng ethoxyquin [19], [20] [21]V.1. Phương pháp tham khảo AOAC 2007.01 V.1. Phương pháp tham khảo AOAC 2007.01
Phương pháp này được sử dụng đầu tiên vào năm 2007, áp dụng cho một số loại thuốc trừ sâu có trong nho, rau diếp và cam như: atrazine, azoxystrobin, bifenthrin, carbaryl, chlorothalonil, lorpyrifos, chlorpyrifos-methyl, l-cyhalothrin (phát sinh trong rau diếp), cyprodinil, dichlorvos, endosulfan sulfate, ethion (phát sinh trong cam), imazalil, Imidacloprid, kresoxim-methyl (phát sinh trong nho) và trifluralin. Phương pháp này cũng được áp dụng cho những chất khác tương tự như thuốc trừ sâu trong đó có ethoxyquin. Giới hạn định lượng của phương pháp là <10ppb.
Nguyên tắc
Trong phương pháp QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe), ACN được sử dụng làm dung mơi để chiết xuất chất cần phân tích từ mẫu, sau đó sử dụng muối MgSO4 để tách nước cịn lại trong mẫu ra khỏi dung dịch chiết. Acid hữu cơ, nước dư và các thành phần khác được loại bỏ bằng cách kết hợp chất hấp thụ PSA ( primary secondary amine) và MgSO4.
23
Mỗi gam mẫu được hòa tan với 1ml acid acetic (1%) trong ACN và 0,5 gam MgSO4 khan/NaOAc (4:1). Cho hỗn hợp trên vào ống nhựa rồi lắc và đem li tâm. Sau khi li tâm, phần dung dịch chiết xuất (lớp trên) được cho vào ống nghiệm có chứa muối MgSO4 khan/ chất hấp thụ PSA (3:1, với 200mg cho 1ml dung dịch chiết xuất), vortex rồi đem li tâm. Cuối cùng, dung dịch chiết xuất được cho vào vial và được phân tích bằng GC/MS hoặc LC/MS/MS.
V.2. Phân tích dư lượng ethoxyquin bằng máy HPLC
Một phương pháp mới đã được phát triển để xác định dư lượng ethoxyquin (EQ), QI và DM trong thức ăn cho cá, QI và DM là sản phẩm của q trình oxy hóa EQ. Mẫu được chiết xuất với hexane, sau đó thổi khơ và định mức với acetonitrile. Dung dịch mẫu được phân tích bằng sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột pha đảo C18, đầu dò UV với = 280nm. Pha động được sử dụng là hỗn hợp acetonitrile 0,01 M và ammonium acetate (80:20).
V.3. Phân tích dư lượng ethoxyquin bằng máy HPLC/MS/MS
Ethoxyquin trong mẫu được chiết xuất bởi hexane sau đó được phân tích trên máy LC/MS/MS với cột pha đảo C18. Pha động là hỗn hợp acid fomic và ammonium acetate với tỉ lệ thích hợp. Ion mẹ được chọn có m/z là 218,1 và hai ion con được chọn để phân tích định tính và định lượng có m/z lần lượt là 147,9 và 175,9. Giới hạn phát hiện (LOD) là 5ppb. Khoảng tuyến tính được chọn là 20 – 200ppb.
24
B. THỰC NGHIỆM [4], [5], [8], [20]
Xác định hàm lượng chất chống oxy hóa – ethoxyquin có trong tơm bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dị khối phổ ba tứ cực (LC/MS/MS).
Nguyên tắc
Mẫu sau khi được đồng nhất, chiết xuất bằng ACN, làm sạch bằng phương pháp QuEChERS sẽ đem phân tích trên máy LC/MS/MS Aligent 6410B.
Phạm vi áp dụng
Xác định hàm lượng ethoxyquin trong thủy sản với giới hạn phát hiện LOD = 3ppb và giới hạn định lượng LOQ = 9ppb.
I. Các thiết bị, dụng cụ và hóa chất I.1. Hệ thống máy LC/MS/MS I.1. Hệ thống máy LC/MS/MS
Bơm gradient Binary pump SL.
Bộ tiêm mẫu tự động Hip–ALS.
Hệ điều nhiệt TCC–SL.
Đầu dò Triple Quad LC/MS/MS 6410B.
Cột XDB–C18; 2,7µm; 2,1x50 mm và cột bảo vệ hoặc tương đương.
I.2. Các thiết bị và dụng cụ
Máy lắc STUART.
Máy ly tâm lạnh HERMLEZ.
Máy vortex.
Bồn siêu âm có gia nhiệt ELMA.
Cân phân tích gram, chính xác tới 0,0001g.
Cân phân tích miligram, chính xác tới 0,001g.
Micropipet loại 20-200µl và 100-1000 µl.
Ống nhựa 50ml chịu được dung môi.
Giấy lọc Ø = 11cm.
Bình erlen 250ml.
Pipet 1ml, 5ml.
Bình định mức 10ml, 25ml, 50ml.
I.3. Hóa chất
25
Axit fomic ≥ 99%
Nước cất 2 lần không ion.
Muối NaCl và MgSO4 của Trung Quốc.
Chuẩn Ethoxyquin của hãng Fluka.
Pha động A: Lọc nước cất hai lần khử ion qua hệ thống lọc pha động với giấy lọc 0,45µm. Cho vào bình đựng mơi 4000ml. Đánh siêu âm 30 phút.
Pha động B: Cho acetonitril (ACN) vào bình chứa 4000ml đến đầy vạch, đánh siêu âm 30 phút.
II. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn II.1. Dung dịch chuẩn gốc II.1. Dung dịch chuẩn gốc
Chuẩn Co (100ppm): cân chính xác 1,022mg chuẩn ethoxyquin, định mức thành 10ml bằng acetonitril (hàm lượng tinh khiết của chuẩn gốc là 97,8%). Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
II.2. Dung dịch chuẩn trung gian
Chuẩn trung gian 1 (10ppm): lấy 1ml chuẩn Co cho vào bình định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 2 (1ppm): lấy 1ml chuẩn 10ppm định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 3 (100ppb): lấy 1ml chuẩn 1ppm định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 4 (50ppb): lấy 5ml chuẩn 100ppb định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4-8oC, bền trong một tháng.
II.3. Dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn C1: Lấy 320μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 16ppb.
Chuẩn C2: Lấy 160μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 8ppb.
Chuẩn C3 Lấy 80μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 4ppb.
Chuẩn C4: Lấy 40μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 2ppb.
26
Chuẩn C5: Lấy 20μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 1ppb.
Các chuẩn C1→ C5 pha hằng ngày.
III. Chọn lọc các yếu tố trong phân tích [8]III.1. Khảo sát khoảng tuyến tính III.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Thực hiện
Pha một dãy các chất chuẩn có nồng độ lần lượt là 1; 2; 4; 8; 16ppb. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký và ghi nhận diện tích peak tương ứng. Từ số liệu thu được sẽ tính tốn được R2, để đảm bảo u cầu về tính tuyến tính thì R2 ≥ 0,99.
Nồng độ (ppb) 0 1 2 4 8 16
Diện tích peak 47 1000 1138 2819 5604 12300
Bảng 3. Kết quả dựng đường chuẩn Ethoxyquin
y = 751.27x R2 = 0.9955 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nồng độ (ppb) d iệ n tí c h p e a k
Hình 10. Đường chuẩn Ethoxyquin Trục X: nồng độ dung dịch chuẩn (ppb). Trục X: nồng độ dung dịch chuẩn (ppb).
Y: diện tích peak tương ứng.
III.2. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
27
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng . Độ đúng được tính tốn trên tỷ lệ phần trăm thu hồi trong định lượng khi thêm vào một lượng chất tan đã cho biết vào mẫu đo.
Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều này do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, ta khơng thể kiểm sốt được hồn tồn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Do đó, để kiểm sốt được các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm chỉ mức độ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh trị giá trung bình. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn.
Độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV được tính theo các cơng thức sau:
1 ) ( 2 _ n x SD i x RSD% = CV% = _ 100 x SD Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm
xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”
x
_
: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm. RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối.
CV%: Hệ số biến thiên
III.2.1. Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng là mẫu tơm đã được phân tích ethoxyquin nhiều lần (n=7) và sắc ký đồ khơng có mũi ethoxyquin. Mẫu tơm được đồng nhất và cho vào túi nilon bảo quản ở -20oC, dùng làm mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn.
28
Mẫu thêm chuẩn (M+C): Mẫu trắng cân 2g, tiêm vào mẫu dung dịch chuẩn 10ppb ethoxyquin (tiêm 0,1ml chuẩn C1 200ppb), vortex, để yên 30 phút, xử lí mẫu theo qui trình III.2.2.
III.2.2. Xử lí mẫu
Sơ đồ tóm tắt qui trình xử lí mẫu trong đề tài
III.2.3. Các thông số cài đặt của máy HPLC/MS/MS
Điều kiện của máy HPLC 6410B Pha động A: H2O
Rút khoảng 1ml dung dịch mẫu phân tích cho vào vial
Máy HPLC/MS/MS Đánh vortex Ly tâm
Lọc vào ống nhựa có chứa 0,2g NaCl, 0,6g MgSO4 và 0,1g PSA
Đánh vortex Ly tâm
Rút 2ml dung dịch mẫu phân tích cho vào ống nghiệm có chứa 0,2g MgSO4 và
0,1g PSA
Đánh vortex Lắc 30 phút Ly tâm Cân 2g mẫu cho vào ống nhựa
+ 5ml acetonitril Đồng nhất mẫu
29 Pha động B: ACN Cột XDB–C18; 2,7µm; 2,1x50 mm Thời gian (phút) %B Tốc độ dòng (ml/phút) 0 25% 0,4 4 100% 0,4 10 100% 0,4 Thể tích tiêm: 10µl
Time stop: 10 min
Post time: 5 min
Điều kiện MS Source: ESI+
Gas temp: 300oC
Gas flow: 10 l/min
Nebulizer: 40psi
Capillary: 4000V
Scan type: MRM
Ion định lượng Ion định tính
Ethoxyquin 218,2 → 148,1 218,2 → 174,2
Năng lượng phân mảnh (V) 22 26
III.2.4. Cơng thức tính tốn kết quả
Hàm lượng Ethoxyquin trong mẫu =
m V X
(ppb)
X: nồng độ (ppb) có được từ diện tích peak mẫu với phương trình đường chuẩn. V: Thể tích pha lỗng (ml).
m: Khối lượng mẫu ban đầu (g).
Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện (LOD)
T C LOD3 Cmin
30
CCmin : Nồng độ dung dịch chuẩn nhỏ nhất tiêm vào máy ứng với 3 ≤ T ≤ 10
N S
TC : Tỷ lệ tín hiệu (signal) trên nhiễu (noise) ứng với CCmin.
Giới hạn định lượng của phương pháp
LOQ = 3LOD
III.2.5. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Sau khi khảo sát 18 mẫu thêm chuẩn (M+C) ở 3 nồng độ khác nhau (5, 10, 15ppb), mỗi nồng độ có 6 mẫu, kết quả thu được như sau:
Nền mẫu Tên mẫu Cspike (ppb)
Crecovery
(ppb) Hiệu suất thu hồi (%)
Tôm
M + C1 5 3,45 63,04 - 76,24
M + C2 10 7,23 62,15 - 77,5
M + C3 15 10,90 71,28 - 73,88