V. Các phương pháp xác định hàm lượng ethoxyquin [19], [20] [21]V.1. Phương pháp tham khảo AOAC 2007.01 V.1. Phương pháp tham khảo AOAC 2007.01
Phương pháp này được sử dụng đầu tiên vào năm 2007, áp dụng cho một số loại thuốc trừ sâu có trong nho, rau diếp và cam như: atrazine, azoxystrobin, bifenthrin, carbaryl, chlorothalonil, lorpyrifos, chlorpyrifos-methyl, l-cyhalothrin (phát sinh trong rau diếp), cyprodinil, dichlorvos, endosulfan sulfate, ethion (phát sinh trong cam), imazalil, Imidacloprid, kresoxim-methyl (phát sinh trong nho) và trifluralin. Phương pháp này cũng được áp dụng cho những chất khác tương tự như thuốc trừ sâu trong đó có ethoxyquin. Giới hạn định lượng của phương pháp là <10ppb.
Nguyên tắc
Trong phương pháp QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe), ACN được sử dụng làm dung mơi để chiết xuất chất cần phân tích từ mẫu, sau đó sử dụng muối MgSO4 để tách nước còn lại trong mẫu ra khỏi dung dịch chiết. Acid hữu cơ, nước dư và các thành phần khác được loại bỏ bằng cách kết hợp chất hấp thụ PSA ( primary secondary amine) và MgSO4.
23
Mỗi gam mẫu được hòa tan với 1ml acid acetic (1%) trong ACN và 0,5 gam MgSO4 khan/NaOAc (4:1). Cho hỗn hợp trên vào ống nhựa rồi lắc và đem li tâm. Sau khi li tâm, phần dung dịch chiết xuất (lớp trên) được cho vào ống nghiệm có chứa muối MgSO4 khan/ chất hấp thụ PSA (3:1, với 200mg cho 1ml dung dịch chiết xuất), vortex rồi đem li tâm. Cuối cùng, dung dịch chiết xuất được cho vào vial và được phân tích bằng GC/MS hoặc LC/MS/MS.
V.2. Phân tích dư lượng ethoxyquin bằng máy HPLC
Một phương pháp mới đã được phát triển để xác định dư lượng ethoxyquin (EQ), QI và DM trong thức ăn cho cá, QI và DM là sản phẩm của q trình oxy hóa EQ. Mẫu được chiết xuất với hexane, sau đó thổi khơ và định mức với acetonitrile. Dung dịch mẫu được phân tích bằng sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC) với cột pha đảo C18, đầu dò UV với = 280nm. Pha động được sử dụng là hỗn hợp acetonitrile 0,01 M và ammonium acetate (80:20).
V.3. Phân tích dư lượng ethoxyquin bằng máy HPLC/MS/MS
Ethoxyquin trong mẫu được chiết xuất bởi hexane sau đó được phân tích trên máy LC/MS/MS với cột pha đảo C18. Pha động là hỗn hợp acid fomic và ammonium acetate với tỉ lệ thích hợp. Ion mẹ được chọn có m/z là 218,1 và hai ion con được chọn để phân tích định tính và định lượng có m/z lần lượt là 147,9 và 175,9. Giới hạn phát hiện (LOD) là 5ppb. Khoảng tuyến tính được chọn là 20 – 200ppb.
24
B. THỰC NGHIỆM [4], [5], [8], [20]
Xác định hàm lượng chất chống oxy hóa – ethoxyquin có trong tơm bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ba tứ cực (LC/MS/MS).
Nguyên tắc
Mẫu sau khi được đồng nhất, chiết xuất bằng ACN, làm sạch bằng phương pháp QuEChERS sẽ đem phân tích trên máy LC/MS/MS Aligent 6410B.
Phạm vi áp dụng
Xác định hàm lượng ethoxyquin trong thủy sản với giới hạn phát hiện LOD = 3ppb và giới hạn định lượng LOQ = 9ppb.
I. Các thiết bị, dụng cụ và hóa chất I.1. Hệ thống máy LC/MS/MS I.1. Hệ thống máy LC/MS/MS
Bơm gradient Binary pump SL.
Bộ tiêm mẫu tự động Hip–ALS.
Hệ điều nhiệt TCC–SL.
Đầu dò Triple Quad LC/MS/MS 6410B.
Cột XDB–C18; 2,7µm; 2,1x50 mm và cột bảo vệ hoặc tương đương.
I.2. Các thiết bị và dụng cụ
Máy lắc STUART.
Máy ly tâm lạnh HERMLEZ.
Máy vortex.
Bồn siêu âm có gia nhiệt ELMA.
Cân phân tích gram, chính xác tới 0,0001g.
Cân phân tích miligram, chính xác tới 0,001g.
Micropipet loại 20-200µl và 100-1000 µl.
Ống nhựa 50ml chịu được dung môi.
Giấy lọc Ø = 11cm.
Bình erlen 250ml.
Pipet 1ml, 5ml.
Bình định mức 10ml, 25ml, 50ml.
I.3. Hóa chất
25
Axit fomic ≥ 99%
Nước cất 2 lần không ion.
Muối NaCl và MgSO4 của Trung Quốc.
Chuẩn Ethoxyquin của hãng Fluka.
Pha động A: Lọc nước cất hai lần khử ion qua hệ thống lọc pha động với giấy lọc 0,45µm. Cho vào bình đựng mơi 4000ml. Đánh siêu âm 30 phút.
Pha động B: Cho acetonitril (ACN) vào bình chứa 4000ml đến đầy vạch, đánh siêu âm 30 phút.
II. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn II.1. Dung dịch chuẩn gốc II.1. Dung dịch chuẩn gốc
Chuẩn Co (100ppm): cân chính xác 1,022mg chuẩn ethoxyquin, định mức thành 10ml bằng acetonitril (hàm lượng tinh khiết của chuẩn gốc là 97,8%). Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
II.2. Dung dịch chuẩn trung gian
Chuẩn trung gian 1 (10ppm): lấy 1ml chuẩn Co cho vào bình định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 2 (1ppm): lấy 1ml chuẩn 10ppm định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 3 (100ppb): lấy 1ml chuẩn 1ppm định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 4 (50ppb): lấy 5ml chuẩn 100ppb định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4-8oC, bền trong một tháng.
II.3. Dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn C1: Lấy 320μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 16ppb.
Chuẩn C2: Lấy 160μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 8ppb.
Chuẩn C3 Lấy 80μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 4ppb.
Chuẩn C4: Lấy 40μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 2ppb.
26
Chuẩn C5: Lấy 20μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 1ppb.
Các chuẩn C1→ C5 pha hằng ngày.
III. Chọn lọc các yếu tố trong phân tích [8]III.1. Khảo sát khoảng tuyến tính III.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Thực hiện
Pha một dãy các chất chuẩn có nồng độ lần lượt là 1; 2; 4; 8; 16ppb. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký và ghi nhận diện tích peak tương ứng. Từ số liệu thu được sẽ tính tốn được R2, để đảm bảo yêu cầu về tính tuyến tính thì R2 ≥ 0,99.
Nồng độ (ppb) 0 1 2 4 8 16
Diện tích peak 47 1000 1138 2819 5604 12300
Bảng 3. Kết quả dựng đường chuẩn Ethoxyquin
y = 751.27x R2 = 0.9955 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nồng độ (ppb) d iệ n tí c h p e a k