y = 751.27x R2 = 0.9955 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nồng độ (ppb) d iệ n tí c h p e a k
Hình 10. Đường chuẩn Ethoxyquin Trục X: nồng độ dung dịch chuẩn (ppb). Trục X: nồng độ dung dịch chuẩn (ppb).
Y: diện tích peak tương ứng.
III.2. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
27
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng . Độ đúng được tính tốn trên tỷ lệ phần trăm thu hồi trong định lượng khi thêm vào một lượng chất tan đã cho biết vào mẫu đo.
Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều này do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, ta khơng thể kiểm sốt được hồn tồn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Do đó, để kiểm sốt được các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm chỉ mức độ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh trị giá trung bình. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn.
Độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV được tính theo các cơng thức sau:
1 ) ( 2 _ n x SD i x RSD% = CV% = _ 100 x SD Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm
xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”
x
_
: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm. RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối.
CV%: Hệ số biến thiên
III.2.1. Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng là mẫu tơm đã được phân tích ethoxyquin nhiều lần (n=7) và sắc ký đồ khơng có mũi ethoxyquin. Mẫu tơm được đồng nhất và cho vào túi nilon bảo quản ở -20oC, dùng làm mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn.
28
Mẫu thêm chuẩn (M+C): Mẫu trắng cân 2g, tiêm vào mẫu dung dịch chuẩn 10ppb ethoxyquin (tiêm 0,1ml chuẩn C1 200ppb), vortex, để yên 30 phút, xử lí mẫu theo qui trình III.2.2.
III.2.2. Xử lí mẫu
Sơ đồ tóm tắt qui trình xử lí mẫu trong đề tài
III.2.3. Các thơng số cài đặt của máy HPLC/MS/MS
Điều kiện của máy HPLC 6410B Pha động A: H2O
Rút khoảng 1ml dung dịch mẫu phân tích cho vào vial
Máy HPLC/MS/MS Đánh vortex Ly tâm
Lọc vào ống nhựa có chứa 0,2g NaCl, 0,6g MgSO4 và 0,1g PSA
Đánh vortex Ly tâm
Rút 2ml dung dịch mẫu phân tích cho vào ống nghiệm có chứa 0,2g MgSO4 và
0,1g PSA
Đánh vortex Lắc 30 phút Ly tâm Cân 2g mẫu cho vào ống nhựa
+ 5ml acetonitril Đồng nhất mẫu
29 Pha động B: ACN Cột XDB–C18; 2,7µm; 2,1x50 mm Thời gian (phút) %B Tốc độ dòng (ml/phút) 0 25% 0,4 4 100% 0,4 10 100% 0,4 Thể tích tiêm: 10µl
Time stop: 10 min
Post time: 5 min
Điều kiện MS Source: ESI+
Gas temp: 300oC
Gas flow: 10 l/min
Nebulizer: 40psi
Capillary: 4000V
Scan type: MRM
Ion định lượng Ion định tính
Ethoxyquin 218,2 → 148,1 218,2 → 174,2
Năng lượng phân mảnh (V) 22 26
III.2.4. Cơng thức tính tốn kết quả
Hàm lượng Ethoxyquin trong mẫu =
m V X
(ppb)
X: nồng độ (ppb) có được từ diện tích peak mẫu với phương trình đường chuẩn. V: Thể tích pha lỗng (ml).
m: Khối lượng mẫu ban đầu (g).
Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện (LOD)
T C LOD3 Cmin
30
CCmin : Nồng độ dung dịch chuẩn nhỏ nhất tiêm vào máy ứng với 3 ≤ T ≤ 10
N S
TC : Tỷ lệ tín hiệu (signal) trên nhiễu (noise) ứng với CCmin.
Giới hạn định lượng của phương pháp
LOQ = 3LOD
III.2.5. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Sau khi khảo sát 18 mẫu thêm chuẩn (M+C) ở 3 nồng độ khác nhau (5, 10, 15ppb), mỗi nồng độ có 6 mẫu, kết quả thu được như sau:
Nền mẫu Tên mẫu Cspike (ppb)
Crecovery
(ppb) Hiệu suất thu hồi (%)
Tôm
M + C1 5 3,45 63,04 - 76,24
M + C2 10 7,23 62,15 - 77,5
M + C3 15 10,90 71,28 - 73,88