II.1. Dung dịch chuẩn gốc
Chuẩn Co (100ppm): cân chính xác 1,022mg chuẩn ethoxyquin, định mức thành 10ml bằng acetonitril (hàm lượng tinh khiết của chuẩn gốc là 97,8%). Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
II.2. Dung dịch chuẩn trung gian
Chuẩn trung gian 1 (10ppm): lấy 1ml chuẩn Co cho vào bình định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 2 (1ppm): lấy 1ml chuẩn 10ppm định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 3 (100ppb): lấy 1ml chuẩn 1ppm định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4 - 8oC, bền trong một tháng.
Chuẩn trung gian 4 (50ppb): lấy 5ml chuẩn 100ppb định mức thành 10ml bằng acetonitril. Chuẩn lưu trong tối, nhiệt độ 4-8oC, bền trong một tháng.
II.3. Dung dịch chuẩn làm việc
Chuẩn C1: Lấy 320μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 16ppb.
Chuẩn C2: Lấy 160μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 8ppb.
Chuẩn C3 Lấy 80μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 4ppb.
Chuẩn C4: Lấy 40μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 2ppb.
26
Chuẩn C5: Lấy 20μl chuẩn 50ppb cho vào bình định mức 1ml, thêm acetonitril đến vạch, lắc đều sẽ được chuẩn 1ppb.
Các chuẩn C1→ C5 pha hằng ngày.
III. Chọn lọc các yếu tố trong phân tích [8]III.1. Khảo sát khoảng tuyến tính III.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích.
Thực hiện
Pha một dãy các chất chuẩn có nồng độ lần lượt là 1; 2; 4; 8; 16ppb. Tiến hành phân tích trên máy sắc ký và ghi nhận diện tích peak tương ứng. Từ số liệu thu được sẽ tính tốn được R2, để đảm bảo u cầu về tính tuyến tính thì R2 ≥ 0,99.
Nồng độ (ppb) 0 1 2 4 8 16
Diện tích peak 47 1000 1138 2819 5604 12300
Bảng 3. Kết quả dựng đường chuẩn Ethoxyquin
y = 751.27x R2 = 0.9955 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nồng độ (ppb) d iệ n tí c h p e a k
Hình 10. Đường chuẩn Ethoxyquin Trục X: nồng độ dung dịch chuẩn (ppb). Trục X: nồng độ dung dịch chuẩn (ppb).
Y: diện tích peak tương ứng.
III.2. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
27
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng . Độ đúng được tính tốn trên tỷ lệ phần trăm thu hồi trong định lượng khi thêm vào một lượng chất tan đã cho biết vào mẫu đo.
Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và với những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều này do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, ta khơng thể kiểm sốt được hồn tồn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Do đó, để kiểm sốt được các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm chỉ mức độ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh trị giá trung bình. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn.
Độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV được tính theo các cơng thức sau:
1 ) ( 2 _ n x SD i x RSD% = CV% = _ 100 x SD Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghiệm
xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”
x
_
: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm. RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối.
CV%: Hệ số biến thiên
III.2.1. Chuẩn bị mẫu kiểm soát
Chuẩn bị mẫu trắng: mẫu trắng là mẫu tơm đã được phân tích ethoxyquin nhiều lần (n=7) và sắc ký đồ khơng có mũi ethoxyquin. Mẫu tơm được đồng nhất và cho vào túi nilon bảo quản ở -20oC, dùng làm mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn.
28
Mẫu thêm chuẩn (M+C): Mẫu trắng cân 2g, tiêm vào mẫu dung dịch chuẩn 10ppb ethoxyquin (tiêm 0,1ml chuẩn C1 200ppb), vortex, để yên 30 phút, xử lí mẫu theo qui trình III.2.2.
III.2.2. Xử lí mẫu
Sơ đồ tóm tắt qui trình xử lí mẫu trong đề tài
III.2.3. Các thông số cài đặt của máy HPLC/MS/MS
Điều kiện của máy HPLC 6410B Pha động A: H2O
Rút khoảng 1ml dung dịch mẫu phân tích cho vào vial
Máy HPLC/MS/MS Đánh vortex Ly tâm
Lọc vào ống nhựa có chứa 0,2g NaCl, 0,6g MgSO4 và 0,1g PSA
Đánh vortex Ly tâm
Rút 2ml dung dịch mẫu phân tích cho vào ống nghiệm có chứa 0,2g MgSO4 và
0,1g PSA
Đánh vortex Lắc 30 phút Ly tâm Cân 2g mẫu cho vào ống nhựa
+ 5ml acetonitril Đồng nhất mẫu
29 Pha động B: ACN Cột XDB–C18; 2,7µm; 2,1x50 mm Thời gian (phút) %B Tốc độ dòng (ml/phút) 0 25% 0,4 4 100% 0,4 10 100% 0,4 Thể tích tiêm: 10µl
Time stop: 10 min
Post time: 5 min
Điều kiện MS Source: ESI+
Gas temp: 300oC
Gas flow: 10 l/min
Nebulizer: 40psi
Capillary: 4000V
Scan type: MRM
Ion định lượng Ion định tính
Ethoxyquin 218,2 → 148,1 218,2 → 174,2
Năng lượng phân mảnh (V) 22 26
III.2.4. Cơng thức tính tốn kết quả
Hàm lượng Ethoxyquin trong mẫu =
m V X
(ppb)
X: nồng độ (ppb) có được từ diện tích peak mẫu với phương trình đường chuẩn. V: Thể tích pha lỗng (ml).
m: Khối lượng mẫu ban đầu (g).
Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện (LOD)
T C LOD3 Cmin
30
CCmin : Nồng độ dung dịch chuẩn nhỏ nhất tiêm vào máy ứng với 3 ≤ T ≤ 10
N S
TC : Tỷ lệ tín hiệu (signal) trên nhiễu (noise) ứng với CCmin.
Giới hạn định lượng của phương pháp
LOQ = 3LOD
III.2.5. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp
Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Sau khi khảo sát 18 mẫu thêm chuẩn (M+C) ở 3 nồng độ khác nhau (5, 10, 15ppb), mỗi nồng độ có 6 mẫu, kết quả thu được như sau:
Nền mẫu Tên mẫu Cspike (ppb)
Crecovery
(ppb) Hiệu suất thu hồi (%)
Tôm
M + C1 5 3,45 63,04 - 76,24
M + C2 10 7,23 62,15 - 77,5
M + C3 15 10,90 71,28 - 73,88
Bảng 4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Cspike: nồng độ dung dịch chuẩn thêm vào mẫu.
Crecovery: nồng độ thu hồi được sau khi phân tích (giá trị ghi trên bảng 4 là giá trị trung bình của 6 mẫu có cùng nồng độ).
Hiệu suất thu hồi có giá trị nằm trong khoảng từ hiệu suất thấp nhất đến hiệu suất cao nhất của 6 mẫu có cùng nồng độ.
Kết quả thu được hiệu suất thu hồi năm trong khoảng 60% - 115% (theo tiêu chuẩn của AOAC) , vậy độ đúng có thể chấp nhận được.
Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp
Sau khi khảo sát 18 mẫu thêm chuẩn (M+C) ở 3 nồng độ khác nhau (5, 10, 15ppb), mỗi nồng độ có 6 mẫu, kết quả thu được như sau:
Nền mẫu Tên mẫu Cspike (ppb) Crecovery (ppb) Độ lệch chuẩn SD RSD (%) Tôm M + C1 5 3,45 0,26 7,44 M + C2 10 7,23 0,56 7,77 M + C3 15 10,90 0,14 1,29
31
Cspike: nồng độ dung dịch chuẩn thêm vào mẫu.
Crecovery: nồng độ thu hồi được sau khi phân tích (giá trị ghi trên bảng 5 là giá trị trung bình của 6 mẫu có cùng nồng độ).
Kết quả thu được RSD < 15% (theo tiêu chuẩn của AOAC) , vậy độ chụm có thể chấp nhận được.
Kết luận
Kết quả khảo sát cho thấy:
Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát vớiR2 = 0,9955.
Độ đúng và độ chụm đều nằm trong khoảng chấp nhận được theo tiêu chuẩn của AOAC.
Từ 2 yếu tố trên có thể kết luận phương pháp sử dụng là đáng tin cậy.
IV. Thu mua mẫu
Mẫu được thu mua ở một số chợ tại thành phố Cần Thơ: chợ Xuân Khánh, chợ An Lạc, chợ An Nghiệp, chợ Bình Thủy, chợ Hưng Lợi, chợ Cái Răng, chợ Phú Thứ.
Chợ Số mẫu thu mua Ngày thu mua
Tôm sú Tôm thẻ
Xuân Khánh – Quận Ninh Kiều 4 4 14/1/2013
An Lạc – Quận Ninh Kiều 4 4 14/1/2013
An Nghiệp – Quận Ninh Kiều 4 4 14/1/2013
Bình Thủy – Quận Bình Thủy 4 4 14/1/2013
Hưng Lợi – Quận Ninh Kiều 4 4 15/1/2013
Cái Răng – Quận Cái Răng 4 4 15/1/2013
Phú Thứ– Quận Cái Răng 4 4 15/1/2013
Bảng 6. Số lượng mẫu thu mua ở các chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ
V. Kết quả phân tích
Sau khi tiến hành thu mua 56 mẫu tôm (gồm 28 mẫu tôm sú và 28 mẫu tôm thẻ) và xử lí theo qui trình III.2.2 thu được kết quả sau:
32
Loại tôm
Số mẫu phát hiện dư lượng
Số mẫu khơng phát hiện Tổng số mẫu Số mẫu có dư lượng > MRL Số mẫu có dư lượng < MRL Tôm sú và tôm thẻ 12 10 34 56 Tỷ lệ (%) 21,43 17,86 60,71 100
Bảng 7. Kết quả phân tích tổng hợp dư lượng chất chống oxy hóa ethoxyqiun trên cả hai nền mẫu tôm sú và tôm thẻ
Thảo luận
Kết quả phân tích được số mẫu phát hiện dư lượng ethoxyquin là 22/56 mẫu chiếm tỉ lệ 39,29%. Có 12/56 mẫu có dư lượng > MRL chiếm tỉ lệ 21,43% và có 10/56 mẫu có dư lượng < MRL chiếm tỉ lệ 17,86%. Số mẫu không phát hiện dư lượng ethoxyquin là 34/56 mẫu chiếm tỉ lệ 60,71%.
V.1. Kết quả phân tích dư lượng chất chống oxy hóa - ethoxyqiun trên nền mẫu tơm sú mẫu tôm sú
Loại tôm
Số mẫu phát hiện dư lượng
Số mẫu không phát hiện Tổng số mẫu Số mẫu có dư lượng > MRL Số mẫu có dư lượng < MRL Tôm sú 4 6 18 28 Tỷ lệ (%) 14,29 21,43 64,29 100
Bảng 8. Kết quả phân tích dư lượng chất chống oxy hóa ethoxyqiun trên nền mẫu tôm sú
33
Bảng 9. Dư lượng của một số mẫu nhiễm ethoxyquin trên nền mẫu tôm sú
Thảo luận
Kết quả phân tích có 10/28 mẫu phát hiện dư lượng ethoxyquin chiếm 35,71%. Trong đó có 4 mẫu có dư lượng vượt mức cho phép chiếm tỉ lệ 14,29% và 6 mẫu có dư lượng thấp hơn mức cho phép chiếm tỉ lệ 21,43%. Còn lại 18 mẫu không phát hiện dư lượng ethoxyquin chiếm tỉ lệ 64,29%.
Các mẫu nhiễm ethoxyquin có hàm lượng tương đối cao so với MRL (10ppb) mà Nhật Bản đã cho phép đối với tơm Việt Nam. Mẫu có hàm lượng ethoxyquin cao nhất là mẫu SUAL4 gấp khoảng 16 lần so với MRL.
V.2. Kết quả phân tích dư lượng chất chống oxy hóa ethoxyqiun trên nền mẫu tôm thẻ mẫu tôm thẻ
Loại tôm
Số mẫu phát hiện dư lượng
Số mẫu không phát hiện Tổng số mẫu Số mẫu có dư lượng > MRL Số mẫu có dư lượng < MRL Tôm sú 8 4 16 28 Tỷ lệ (%) 28,57 14,29 57,14 100
Bảng 10. Kết quả phân tích dư lượng chất chống oxy hóa ethoxyqiun trên nền mẫu tôm thẻ
TT Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Dư lượng
(ppb) MRL (ppb)
1 SUXH 2 Chợ Xuân Khánh 8,59
10
2 SUXH 3 Chợ Xuân Khánh 7,28
3 SUHL 2 Chợ Hưng Lợi 16,93
4 SUHL 3 Chợ Hưng Lợi 89,95
5 SUAL 2 Chợ An Lạc 9,52 6 SUAL 3 Chợ An Lạc 3,05 7 SUAL 4 Chợ An Lạc 159,03 8 SUAN 2 Chợ An Nghiệp 23,31 9 SUBT 2 Chợ Bình Thủy 4,53 10 SUBT 3 Chợ Bình Thủy 4,70
34
Bảng 11. Kết quả phân tích dư lượng chất chống oxy hóa ethoxyqiun trên nền mẫu tơm thẻ
Thảo luận
Kết quả phân tích có 12/28 (42,66%) mẫu phát hiện dư lượng ethoxyquin. Trong đó có 8 mẫu có dư lượng vượt mức cho phép chiếm tỉ lệ 28,57% và 4 mẫu có dư lượng thấp hơn mức cho phép chiếm tỉ lệ 14,29 %. Còn lại 16/28 (57,14%) mẫu không phát hiện dư lượng ethoxyquin.
Cũng tương tự như trên nền mẫu tôm sú, các mẫu nhiễm ethoxyquin trên nền mẫu tơm thẻ có hàm lượng tương đối cao so với MRL (10ppb) mà Nhật Bản đã cho phép đối với tơm Việt Nam. Mẫu có hàm lượng ethoxyquin cao nhất là mẫu THEXH1 gấp khoảng 15,3 lần so với MRL.
TT Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Dư lượng
(ppb) MRL (ppb) 1 THEXH 1 Chợ Xuân Khánh 153,34 10 2 THEXH 3 Chợ Xuân Khánh 37,21 3 THEAL 2 Chợ An Lạc 48,71 4 THEAL 3 Chợ An Lạc 6,92 5 THEAN 1 Chợ An Nghiệp 3,74 6 THEAN 2 Chợ An Nghiệp 7,94 7 THEBT 1 Chợ Bình Thủy 18,55 8 THEBT 3 Chợ Bình Thủy 59,47 9 THEBT 4 Chợ Bình Thủy 22,16
10 THECR 2 Chợ Cái Răng 5,88
11 THEPT 2 Chợ Phú Thứ 112,87
35
Phần 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục đích đề ra:
Xây dựng các thông số, chọn lọc điều kiện tối ưu cho quá trình thực nghiệm trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ để có thể phân tích chất chống oxy hóa – ethoxyquin trên nền mẫu tơm (tơm sú và tôm thẻ). Kết quả khảo sát phù hợp với các tiêu chuẩn phân tích của Hiệp hội các nhà phân tích Hóa học (AOAC):
+ Giới hạn phát hiện LOD = 3ppb.
+ Xây dựng đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ đã chọn từ 1 – 16ppb.
+ Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng từ 60 – 115%.
Thu mua 56 mẫu tôm (gồm 28 mẫu tôm sú và 28 mẫu tôm thẻ) ở một số chợ thuộc địa bàn thành phố Cần Thơ và phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ ba tứ cực (LC/MS/MS) với các kết quả như sau:
+ Kết quả phân tích có 22/56 mẫu phát hiện dư lượng ethoxyquin chiếm tỉ lệ 39,29%, trong đó có 12/56 mẫu có dư lượng cao hơn MRL và 12/56 mẫu có dư lượng thấp hơn MRL, số mẫu không phát hiện dư lượng ethoxyquin là 34/56 mẫu chiếm tỉ lệ 60,71%.
+ Trên nền mẫu tôm sú đã phân tích có 10/28 mẫu phát hiện dư lượng ethoxyquin với nồng độ dao động từ 3,05ppb đến 159,03ppb. Trong đó có 4/28 mẫu có dư lượng cao hơn MRL và 6/28 mẫu có dư lượng thấp hơn MRL. Cịn lại 18/28 mẫu khơng phát hiện dư lượng ethoxyquin.
+ Trên nền mẫu tôm thẻ đã phân tích có 12/28 mẫu phát hiện dư lượng ethoxyquin với nồng độ dao động từ 3,74ppb đến 153,34ppb. Trong đó có 8/28 mẫu có dư lượng cao hơn MRL và 4/28 mẫu có dư lượng thấp hơn. Cịn lại 16/28 mẫu khơng phát hiện dư lượng ethoxyquin.
Từ kết quả thu được, có thể kết luận:
Tỉ lệ nhiễm ethoxyquin trên nền mẫu tôm thẻ và tôm sú là tương đương nhau.
Tỉ lệ mẫu có dư lượng ethoxyquin vượt mức cho phép vẫn còn cao.
Dư lương ethoxyquin trong tôm vẫn còn rất cao so với giới hạn cho phép mà Nhật Bản đã đưa ra. Có những mẫu dư lượng ethoxyquin lên đến 159,03ppb,
36
trong khi đó giới hạn cho phép mà Nhật Bản đề ra đối với tôm Việt Nam là 10ppb. Nhìn chung, dư lượng ethoxyquin cịn tồn dư trong các sản phẩm tơm vẫn còn rất cao.
Việc sử dụng ethoxyquin như một chất chống oxy hóa vẫn cịn rất phổ biến.
II. ĐỀ NGHỊ
Thực tế, các sản phẩm tôm khi được xuất khẩu sang thị trường nước ngoài nếu khơng đạt chuẩn chất lượng thì các sẽ bị trả về nước, các sản phẩm này sẽ được mang về các địa phương để tiêu thụ và những người tiêu thụ các sản phẩm này khơng ai khác ngồi người dân. Tuy nhiên, khâu kiểm tra chất lượng sản phẩm ở các địa phương còn rất hạn chế. Khi người dân ăn phải những sản phẩm tơm bị nhiễm các chất bảo quản có