Loại Hêng % Bột bó Câch sử dụng
Silica gel G Merck 13 1 phần si. + 2V H2O
TLC Serva 10 ••• 10g si. + 25 mL H2O
DSF-5 Fluka 5 40g si. +45 mL H2O
DS-S Thụy sĩ 5 Chỉ thị hùynh quang
Silica gel lă chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất
3.2.3. Dung mơi triín khai
Dựa văo đặc điểm của từng loại mẫu mă ta sử dụng hệ dung môi để triển khai sắc ký lă một hỗn hợp có 2, 3 hoặc 4 loại dung mơi khâc nhau với tỉ lệ thích hợp.
Bảng 3.3. Câc hệ dung mơi vă thc thử trong SKLM câc hợp chđt
thiín nhiín
Họp chất
Chất hấp phụ
Hệ dung môi Thuốc thủ'
Alkaloid S1O2G CHCh-MeOH (9:1) CHCl3-Aceton-MeOH-NH3 (20:20:3:1) Benzene-EtOAc- diethylamine (7:2:1) Dragendorff Hoi I2 Saponin S1O2G n-butanol-AcOH-FEO (4:1:5) n-butanol-EtOH-NFEOH (7:2:5) EtOAc-MeOH-H2O (100:17:13) CHCl3-MeOH-H2O (61:32:7) CHCh-MeOH (9:1) ->Genin Vanillin/H3PO4 SbCl3/CHCl3 bêo hòa H2SO4 Liebermann Flavonoid SÌO2G EtOAc-a.formic-FbO (8:1:1) Toluene-EtOAc-MeOH (4:3:1) EtOAc-MeOH-FEO (100:17:13) Toluene-ethylformiate- a.formic (5:4:1) Hơi NH3 KOH 10% FeCl3/MeOH 2% (hoặc/H2O) EtOAc-MeOH-H2O
Coumarin S1O2 G Toluene-EtOAc-MeOH (4:3:1) CHCh-MeOH (9:1) Benzene-Acetone (9:1) EtOAc-MeOH-IbO (100:17:13) p-di nitro benzene Glycoside tim SÌO2G CHCh-MeOH(9:l) Axetone-Toluene-EbO- MeOH-AcOH (40:5:3:2,5:1) EtOAc-pyridine-FbO (50:5:45) EtOAc-MeOH-H2O (80:5:5) Cyclohexane-acetone-AcOH (49:49:2) Dinitro benzene Xanthydrol Tanin SiO2G EtOAc-MeOH-FbO (100:17:13) Toluene-EtOAc-MeOH (4:3:1) FeClj
Tinh dầu S1O2G Benzene-EtOAc (95:5)
Benzene-MeOH (95:5) I2, FI2SO4, H3PO4
Dau bĩo S1O2 G
Ether dầu - ether ethyl ic- AcOH (80:20:1) Ether dau-Benzene (95:5) Hexane-EtOAc(95:5) Ether dầu-Ether (95:5) CHCh-MeOH-FbO (80:20:1) (65:25:4) Hoi I2 Benzidine —>Xanh Rhodamin B —> hong H2SO4 KaliBicromat/FF SƠ4 dd
Amino acid SÌO2G
n-butanol-AcOH-lFO (60:20:20) n-propanol-H2O (64:36) Cồn 96%-H2O (63:37) Phenol-H2O (75:25) n-propanol-EtOAc-H2O (4:3:2) Đường SiO2 G EtOAc-MeOH-AcOH-H2O (70:30:5:5) n-butanol-AcOH-FEO (4:1:1) n-propanol-EtOAc-FỈ2O (4:3:2) Vanillin/ H2SO4 Aniline phtalate Naphtorecorcin
Đối với mẫu đê biết thănh phần hóa học, nín chọn dung mơi có độ tinh khiết cao vă hịa tan được mẫu phđn tích. Khả năng tâch riíng câc chđt có trong mẫu tùy thuộc văo tỷ lệ phđn bố của câc chất giữa chất hấp phụ vă dung môi triển khai. Khỉ thay đối thănh phần dung môi hoặc tỷ lệ thănh phần dung mơi triển khai thì khả năng tâch câc hợp chất cũng thay đơi.
Đối với câc mẫu chất mă chưa được nghiín cứu về thănh phần ta tiến hănh thí nghiệm với câc hệ dung môi khâc nhau, quan sât câc vết, một hộ dung mơi triền khai phù hợp đế có giâ trị Rrphù hợp trong khoảng 0,3-0,7, câc vết tâch rõ. Neu Rf< 0,3 thì hệ dung mơi quâ thấp, Rf> 0,7 thì hệ dung mơi q phđn cực.
Một hệ dung mơi cho giâ trị Rf trong khoảng 0.25 - 0.35 lă phù họp đề đưa mẫu lín cột sắc ký vă có the tâch được cấu tử mong muốn. Khơng nín tìm kiếm dung mơi có giâ trị Rf cao hơn - đặc biệt nếu bạn chi kiểm tra hệ một dung mơi - lăm chất rửa giải vì nó có thể tạo thănh tạp chất dưới dạng một vết chấm khâc (hình 3.2).
Hình 3.2. Lựa chọn giữa dung mồi rửa giải nhanh (trâi) vă dung môi lăm
mất vết tạp chất (phải).
Mặc dù có the có chấm cho giâ trị Rf rất cao, nhưng ngược lại nếu họp chđt mong muốn lă một trong câc vết chấm rửa giải ra sau. Điều năy hoăn toăn có the với câc chấm đi lơn rất chậm (Rf thấp). Hình 3.3 cho thấy chấm sản phẩm mong muôn mới tâch rời vạch xuất phât thì tạp chất đê đi rất xa. Có thơ bạn sẽ lựa chọn dung mơi năy đí trânh nguy cơ tạp chđt gđy ra phđn tâch kĩm vă có giâ trị Rf cao hơn. Điều năy được chứng minh thường
trị Rfthap cũng mất nhiều thời gian vă tốn dung môi. Trong trường hợp năy, tốt hơn lă cố gắng phđn tâch hỗn hợp vă sử dụng nhiều bản mỏng hơn.
Hình 3.3. So sânh giữa dung mơi phđn tâch rõ (bín trâi) vă dung mơi rửa
giải nhanh (bín phải) cho sân phẩm mong muốn.
Khi tìm thấy một hệ dung môi phđn tâch phù hợp, cũng cần xem lại hình dạng của vết sau khi chạy bản mỏng. Neu lý tưởng, câc vết năy sể có hình trịn vă xa câc vết khâc (hình 3.4, vị trí 1). Câc vết với đi dăi trín bản mong có thể do dải rộng vă có khả năng câc hợp chất bị chồng lín nhau níu chạy trín cột. Neu bạn cố thử một số hệ dung môi khâc vă vẫn khơng tìm được hệ cho câc chấm trịn đẹp thì cũng khơng cần lo lắng. Miễn lă việc phđn tâch câc vết tốt thì khi đưa lín cột nó cũng tâch tốt (hình 3.4, vị trí 2). Trong vị trí 3 của hình 3.4, vẫn có thề thu được mẫu sạch của hợp chđt trín cùng, nhưng đương nhiín bạn sẽ bị mất bớt đi một lượng sản phđm vì đi của nó bị dinh văo dải sản phăm tiếp theo trín cột. Vì vậy có thí sử dụng khi khơng qụan tđm lắm đến việc thu hồi sản phấm.
1 2 3 Hình dâng
lý lương
4
Vệt bị kẽo
3.2.4. Câc kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
3.2.4.1. Kỹ thuật sắc ký’ lớp mỏng một chiểu
Khi triển khai sắc ký lớp mỏng, dung mơi chạy tlieo một chiều từ phía dưới lín phía trín của bản mỏng. Để trânh mẫu bị khuếch tân ra dung môi cần để bản mỏng sao cho vết chấm mẫu không ngập trong dung môi.
3.2.4.2. Kỹ thuật sắc ký’ 2 chiểu
Đối với câc mẫu phđn tích có nhiều cấu tử hoặc có một số cấu tử không bền khi chạy TLC để kết quả tâch rõ răng vă đâng tin cậy người ta sử dụng kỹ thuật sắc ký 2 chiều. Bản mỏng được sử dụng trong kỹ thuật năy thường có kích thước lă 20 X 20 hoặc 10x10 cm. Sau khi triển khai sắc ký với hệ dung môi I, bản mỏng được sấy loại dung mơi vă đặt vng góc 90° so với lúc triển khai hệ dung môi I vă tiến hănh triển khai với hệ dung môi II. Hai hệ dung mơi năy có thể khâc hoặc giống nhau. Kỹ thuật SKLM 2 chiều được minh họa trong hình dưới đđy:
Dùng loại bảng vng với.
V
quay 90°
*s2
Hình 3.5. Kỹ thuật sắc ký 2 chiều.
3.2.4.3. Kỹ thuật sắc kỷ điều chế (Preparative Chromatography)
Sắc ký điều chế sử dụng bản mỏng có lóp chất hấp phụ dăy hơn trín tấm thủy tinh với kích thước 20x20, độ dăy của chất hấp phụ thường từ 0,5-Imm. Kỹ thuật năy còn được gọi lă sắc ký chế hóa, thường để tâch câc chất với lượng nhỏ, có Rf xa nhau.
Khi triển khai sắc ký, hỗn hợp mẫu cần tâch được chấm thănh 1 đường liín tục trín bản mỏng. Sau đó triển khai bằng hệ dung mơi thích hợp trong bình triển khai sắc ký chuyín dụng. Trường họp Rf câc chất trong hỗn hợp
rất gần nhau, có thể tiến hănh triển khai nhiều lần, mỗi lần lăm phải sấy khô bảng mỏng.
Để phât hiện câc vết ta sử dụng đỉn tử ngoại chiếu lín hoặc phun thuốc thử lín mĩp của'bản mỏng, trânh phun 1 vùng q rộng vì thuốc thử có thí lăm biến đổi cấu trúc của cấu tử cần tâch để tạo phản ứng mău. Sau khi đânh dấu câc vùng chất cần tâch, chất hấp phụ được cạo ra riíng từng vùng vă sử dụng dung mơi để chiết câc chất ra khỏi chất hấp phụ, quâ trình năỵ được gọi lă phản hấp phụ.
Hình 3.6. Kỹ thuật SKLM điều chế.
3.2.5. Câc ứng dụng của sắc ký lớp mỏng
Kỹ thuật SKLM hiện nay được sử dụng rộng rêi đối với ngănh hóa hữu cơ, đặc biệt lă với hóa học câc hợp chất thiín nhiín. Câc ứng dụng chủ yếu cùa sắc ký lớp mỏng bao gồm:
- Xâc định được độ tinh khiết vă một số đặc trưng của hợp chất thông qua giâ trị Rf trong hệ dung môi xâc định.
- Xâc định thông tin sơ bộ của mẫu chiết như số hợp chất, độ phđn cực cúa câc họp chất trong mẫu để từ đó định hướng câc nghiín cứu tiếp theo như lựa chọn hệ dung môi phù họp cho sắc ký cột.
- Có thế theo dõi q trình sắc ký cột để có thơng tin về câc phđn đoạn tâch hoặc theo dõi tiến trình của phản ứng tơng họp hóa học.
3.3. Sắc ký cột
Sắc ký cột lă một phương phâp chi phí rất thấp được sử dụng để tâch câc hợp chất hóa học từ hỗn hợp câc họp chất. Phương phâp năy rất hữu ích cho việc tâch vă tinh chế chất rắn vă chất lỏng. Pha tĩnh trong sac ký cột được nhồi trong ống hình trụ bằng thĩp hoặc thủy tinh. Tùy theo tính chất cua pha tĩnh mă ta chia ra thănh sắc ký theo cơ chế hấp phụ (cột hấp
phụ), cơ chế phđn bố (cột phđn bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đối ion).
Hình 3.7. Bộ sắc ký cột [BioMedia Việt Nam]
3.3.1. Nguyín tắc
Trong sắc ký cột, pha động lă dung môi được cho chảy qua pha tĩnh được nhồi trong cột. Cột lă những ống lăm bằng thủy tinh hoặc bằng thĩp, đầu dưới có khóa, đầu trín có nút măi để nối với một phễu chứa dung mơi, loại năy thường được bân sẵn trín thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ. Hoặc cột cũng có thí tự Ịấp bằng một ống thủy tinh thường, đầu dưới nhỏ vă được điều chỉnh tốc độ chảy bang khóa. Pha tĩnh nhồi trong sắc ký cột thường dùng lă Oxide nhơm, silica gel, than hoạt tính, polyamide,...
Oxide nhỏm trung tính (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh). Trong nghiín cứu tâch câc hợp chất thiín nhiín, silica gel lă pha tĩnh được dùng rộng rêi nhất. Dung mơi dùng trong sắc ký cột có thí lă từng loại riíng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung mơi với tỉ lệ thích họp.
Độ hoạt hóa số:
I II III IV V
Ơ.5 % H2O 2,4 % H2O 4,3% H2O 6,6% H2O 15% H2O
I II III IV V
1,2 % H2O 3.5 % H2O 5.8% H2O 8.1% H2O 10% H2O
- Silica gel -60 cỡ hat 0,063-0,200 mm. - Polyamide M-K cỡ hạt < 0,07 mm
Kích thước cột ảnh hường rất lớn đến hiệu quả tâch của quâ trình sắc ký cột. Thơng thường cột có đường kính cột nhỏ vă chiều dăi cột căng dăi thì sự tâch căng tốt. Đng kính lOmm 20 mm 30 mm 40 mm 50 mm Rf > 0.2 100 mg 0.5 g 1 g 1.5 g 2.5 g RrO.l 40 mg 150 mg 350 ĩĩig 0.5 g 1 g
Hình 3.8. Lựa chọn đường kính cột sơ bộ [BioMedia Việt Nam] 3.3.2. Kỹ thuật triển khai
3.3.2.1. Chuẩn bị cột
Rửa sạch cột, trâng với dung môi như acetone hoặc nước cất, sau đó để khơ.
Nhồi một ít bơng hoặc vải thủy tinh văo đây cột nếu đây cột khơng có một lớp lọc frit (hoặc thím một lớp cât mịn sạch văo giữa lóp lọc frit vă silica gel).
Cột được kẹp thẳng đứng trín giâ (chú ý sử dụng loại kẹp có bọc cao su đe trânh lăm vỡ cột).
Pha tĩnh trong cột sâc ký cần được phđn tân đồng đều vă tạo thănh khối đồng nhất ở trong cột.
Quâ trình cho chất hấp phụ văo cột được gọi lă nhồi cột. Trọng lượng chất phđn tích
Tỷ lệ = -------------------- -—----------- Trọng lượng chất hấp phụ
Dựa văo việc phđn tích kết quả trín TLC mă ta chọn tỷ lệ chất phđn tích trín tỷ lệ chất hấp phụ cho phù hợp, thơng thường tỷ lệ năy tìr 1/20,
1/50, 1/100...
Bảng 3.4. Hướng dẫn tỷ lệ silica/mẫu phụ thuộc văo khả năng tâch trín
bản mong [BioMediaViet nam]
Phđn tâch
dễ •
•
Tỷ lệ silica gel (g) /mẫu (g): 20:1
Phđn tâch
trung bình •
•
Phđn tâch
khó Tỷ lệ silica gel (g) /mẫu (g): 100:1
- Có 2 câch nhồi cột: nhồi cột ướt vă nhồi cột khô.
Nhồi cột ướt: Đối với câc chất hấp phụ có khả năng trương phình như
silica gel, Sephadex đế trânh việc bị nứt cột thì phải ngđm trong dung môi trước một thời gian trước khi cho văo cột. Cđn vừa đủ lượng chất hấp phụ, sau đó trộn đều với dung mơi thănh một hỗn họp dịch vă rót văo cột, chất hấp phụ sẽ lắng xuống đây cột lăm cho cột trở nín đồng nhất. Đe trânh cột bị bọt khí, hỗn dịch dung mơi vă chất hấp phụ cần vừa phải, không quâ sệt cũng khơng q lỏng đe phải rót nhiều lần. Đe cột ổn định, trong quâ trình nhồi cột cần phải để cho dung mơi chảy liín tục. Cột nhồi xong vẫn đe dung mơi chảy thím một khoảng thịi gian nữa để hoăn toăn ổn định. Người ta thường cho lóp cât hoặc bơng văo bề mặt trín của cột đí trânh lăm xâo trộn gel khi ta cho thím dung mơi văo.
Nhồi cột khô: Đối với câc chất hấp phụ khơng có khả năng trương nở
như AI2O3, CaCƠ3 ta sử dụng phương phâp nhồi cột khô. Cột được dựng thăng đứng, cho lớp bơng văo phía dưới đây cột đí giữ chất hấp phụ. Cđn khối lượng chất hấp phụ vừa đủ rồi cho tự từ văo cột đồng thời dùng bóng cao su gõ đều xung quanh cột từ dưới lín trín de cho chat hấp phụ on định. Khi chat hấp phụ được cho hết văo cột, rót dung mơi văo vă cho chảy liín tục một thời gian để cột được ổn định vă không được đe khơ dung mơi trong cột.
Hình 3.10. Nhồi cột khơ (BioMedia Việt Nam)
3.3.2.2. Đưa chất phđn tích văo cột
Chất phđn tích trước khi cho văo cột được phđn tân đều thănh một lóp mỏng đồng đều trín mặt thơng phăng. Câc phương phâp đe đưa chất phđn tích văo cột thường được sử dụng lă:
Sừ dụng đĩa giấy: Giấy lọc có bề mặt dăy được cât thănh hình trịn nhỏ
có đường kính bĩ hơn đường kính cột khoảng 0,5 mm vă được chđm câc lỗ thủng nhỏ câch đều nhau. Câc tđm giấy lọc nhỏ năy được ngđm trong dung dịch đậm đặc của mẫu cần tâch chất, sau đó lấy giấy ra vă sấy nhẹ đế loại bỏ hết dung mơi. Tùy văo lượng chất, kích thước cột mă có thể sử dụng nhiều lóp giấy lọc.
đĩa giấy. Cho một lớp cât mịn lín trín đĩa giấy vă bắt đầu cho dung môi chảy.
Cho dung dịch mẫu lín cột: Mầu được hịa tan hoăn toăn bằng lượng
dung môi vừa dử? Sử dụng pipet hút dung dịch cho chảy từ từ dọc theo thănh cột. Cho dung dịch mẫu ngấm từ từ văo cột bằng câch mở khóa cho dung mơi chảy ra từ từ. Khi mẫu được đưa hết văo cột. dùng dung môi để rửa thănh cột vă cho dung môi phù hợp văo để tiến hănh sắc ký. Trong quâ trình cho mẫu văo cột chú ý không được để cột bị khô ở lóp chất hđp phụ đầu cột. Phương phâp năy được sử dụng nhiều vì có nhiều ưu điềm đó lă dễ dăng, nhanh gọn. Tuy nhiín can chú ý mẫu phải tan hoăn toăn trong dung môi chạy sắc ký, trong q trình cho mẫu lín vă sắc ký khơng được lăm xâo trộn bề mặt trín của cột. Mau được ngấm từ từ hết văo cột rôi mới cho dung mơi văo để tiến hănh q trình sâc ký.
Trộn mẫu với một lượng chất hấp phụ: cho chất hấp phụ trộn đều với
mẫu đê được hòa tan hoăn toăn trong dung mỏi. Dung mơi được loại bó băng câch sử dụng cô quay chđn không hoặc sấy khơ. Sau đó nghiền nhỏ thănh bột vă cho văo cột trải đều thănh 1 lớp trín bề mặt cột. Tiếp theo, cho dung môi văo vă tiến hănh sắc ký.
3.3.2.3. Rửa cột
Quâ trình giải ly câc hợp chất ra khỏi cột được gọi lă quâ trình rửa cột. Ta có thể tiến hănh rửa cột ở âp suất thường hoặc âp suất nĩn tùy thuộc văo bản chất, đường kính chất hấp phụ hoặc tốc độ của pha động. Neu chất hấp phụ có kích thước lớn. mẫu nhiều chất có độ phđn cực khâc nhau tốc độ chảy chậm nhò’ văo trọng lực. Khi cần điều chỉnh tốc độ chảy theo ý muốn ta sử dụng rửa cột bằng âp suất nĩn. Cột sử dụng âp suđt nĩn cđn có