Gel Bio-Gel
Khả năng tâch câc họp chất theo trọng lưựng
phđn tứ
Thế tích gel trương nỏ’ trong nưóc (mL/g gel khô)
P-2 200-2.000 3.8 P-4 500-4.000 6.1 P-6 1.000-5.000 7.4 P-10 1.500-17.000 12 P-30 20.000-50.000 14 P-60 30.000-70.000 18 P-100 40.000-100.000 22 P-150 50.000-150.000 27 P-200 80.000-300.000 47 P-300 100.000-400.000 70
Tất cả câc loại Xerogel với loại lỗ rỗng to, khi trương nở sẽ cho gel rđt mềm. Đe khắc phục nhược điểm năy, người ta điều chế gel agarose. Agarose lă polysaccharide (lă những đơn vị gồm câc nối 1,3-/7-D-galactose hoặc l,4-/?-D-galactose nối với 3,6-anhydro-a-L-galactose). Ó nhiệt độ >50 °C, gel tan trong nước vă nếu dung dịch để nguội <30 °C, gel được thănh lập vă bấy giờ khơng tan khi <40 °C. Trín nhiệt độ năy, gel nóng chảy hoặc xụp đố. Gel agarose có độ bền hóa học giống như gel Dextran.
Có nhiều loại gel agarose thương mại như: Sepharose, Bio-Gel A, Gelarose, Sagavac. Câc loại gel năy có thể dược sản xuất với lỗ trống rất to. Câc gel agarose có độ bền cơ học cao hơn gel dextran cùng cỡ lỗ. Đí
Gel silica có lỗ rỗng
Nhiều nhă sản xuất có loại gel silica thương mại với nhiều cỡ lồ (Porasil,
Merck-O-Gel) vă có cấu trúc hạt rắn chắc. Gel có thí sử dụng trong một
số dung môi hữu ẹ.ơ, nhưng tốt nhất vẫn lă sử dụng trong nước. Câc loại
gel năy có độ phđn cực tương đơi cao vă gel có thí có khuynh hướng băt giữ câc phđn tử theo cơ che hấp thu.
Gel thủy tinh có lỗ rỗng
Có nhiều loại hạt thủy tinh có lỗ rỗng (Corning, Bio-Glass). Hạt gel năy
có thể được sử dụng trong sắc ký gel, trong cả hai môi trường nước vă
dung môi hữu cơ.
Gel có nhược điểm lă có thể có hiện tượng hấp thu trín bề mặt silica vì câc nhóm mang một phần điện tích đm. Uu điểm của gel lă có cơ cấu rắn
chắc, bền nhiệt, bền lực, sử dụng được trong cả dung môi nước lẫn hữu cơ.
3.5.3. Lựa chọn câc điều kiện hoạt động
Câc yếu tố khâc nhau cần được xem xĩt khi thiết kể hệ thống lọc gel bao gồm: (1) lựa chọn chất nền, (2) kích thước vă nồng độ mẫu, (3) thơng sổ cột, (4) lựa chọn chất rửa giải, (5) ảnh hướng của tốc độ dòng chảy vă
(6) lăm sạch vă băo quản cột.
3.5.3. ỉ. Lựa chọn chai nền
Trong câc điều kiện phđn tâch, chất nền phải trơ đối với câc phđn tử
được tâch ra đe trânh sự hấp phụ một phần của câc phđn tử văo chđt nín, không chỉ lăm chậm sự di chuyển của chúng qua cột mă cịn dẫn đến câc
đỉnh “có đi'’. Tính ổn định của chất nền đối với dung môi hữu cơ. pH vă
nhiệt độ cũng lă một yếu tố quan trọng can xem xĩt vă câc biến số năy phải tương thích với câc đặc tính cúa câc phđn tử được tâch ra. Nín chọn chất
nền có phạm vi phđn đoạn khối lượng phđn tử mă sẽ cho phĩp phđn tử
quan tđm rửa giải sau Vo vă trước Vt. Tuy nhiín, khoảng phđn đoạn phù
hợp nhất sẽ không chỉ được quyết định bởi khối lượng phđn tử của phđn
tử mục tiíu, mă cịn bởi thănh phần của mẫu được âp dụng cho cột. Do đó, sự phđn tâch tốt nhất của câc phđn tử trong một mẫu có khối lượng phđn tử tương tự nhau đạt được băng câch sử dụng chất nín có phạm vi phđn đoạn hẹp.
3.5.3.2. Cỡ mau vă nong độ
sắc ký lọc gel có khả năng xử lý mẫu thấp cố hữu vă do đó, nín được thực hiện muộn trong quy trình tinh chế khi số lượng câc phđn tử khâc nhau trong một mẫu tương đối thấp. Nồng độ của mẫu có thế âp dụng cho cột sẽ bị giới hạn bởi độ nhớt của mẫu (tăng theo nồng độ mẫu) so với dung dịch rửa giải. Độ nhớt cao sẽ dẫn đến việc di chưỳến mẫu khơng đíu qua cột (dẫn đến mat dộ phđn giải sau đó) vă trong một số trường hợp, sẽ lăm giảm tốc độ dịng chảy của cột.
3.5.3.4. Thơng so cột vă lựa chọn dung môi rửa giai
Độ phđn giải tối đa trong sac ký lọc gel thu được với câc cột dăi. Tỷ lệ đường kính cột trín chiều dăi có thế từ 1:20 đến 1: 100. Vì sac ký lọc gel chi tâch câc phđn tử trín cơ sở kích thước tương đối cúa chúng, nín kỹ thuật năy hoăn toăn độc lập vói loại chất rửa giải được sử dụng. Do đó, nín chọn câc điều kiện rửa giải (pH, câc ion thiết yếu, v.v.) đí bơ sung cho câc yíu cầu của phđn tử quan tđm.
3.5.3.5. Anh hưởng cùa tốc độ dòng chay
Tốc dộ dòng chảy thấp cung cấp độ phđn giải tối đa trong quâ trình sắc ký lọc gel vì tốc độ dịng chảy vă độ phđn giải có quan hệ tỷ lệ nghịch với nhau. Tốc độ dòng chảy tối ưu để phđn giải protein lă khoảng 2 mL/cm2/h, mặc dù tốc độ dòng chảy cao hơn nhiều có thế được sử dụng, đặc biệt với câc chất nền cứng như Sephacryl HR của GE Healthcare (30 mL/cm2/h). Nhưng tốc độ dịng chảy thấp thì thời gian tâch dăi hơn. Do đó, phải tính tôn họp lý giữa độ phđn giải mong muốn vă tốc độ.
3.5.3.6. Lảm sạch vă hâo quân cột
Hầu hết câc chất nền lọc gel có thể được lăm sạch bằng natri hydroxit 0,2 M hoặc chất tđy rửa không ion. Khi không sử dụng trong thời gian dăi, chất nền nín được bảo quản ở 4 °C trong bóng tối với sự hiện diện của chất chống vi khuđn.
3.5.4. Thực hănh sắc ký cột lọc geỉ
3.5.4.1. Câc nguyín tắc cơ han đế thực hănh sắc ký cột gcl
Cột sâc ký gel thường được chuẩn bị theo kiểu nhồi cột sệt với huyền phù nguyín liệu gel trong một lượng dung môi phù hợp. Huyền phù gel trong dung mơi (có thể loại bở những hạt cực mịn bâng câch lắng, gạn)
thể chảy được thănh dịng. Muốn có huyền phù gel phải ngđm gel trong dung môi theo điều kiện trong bảng 4.
Bảng 3.18. Thời gian trương nở ngđm gel Sephadex trong dung mơi
Loại gel Thịi gian ngđm
ỏ’ nhiệt độ phòng Thòi gian ngđm õ’ 100 °C G-10, G-15. G-25. G-50 3 giờ 1 giờ G-75 24 giờ 3 giờ G-100. G-150. G-200 3 ngăy 3 giờ
Khi rót huyền phù gel văo cột xong, ốn định cột bằng câch cho dung môi giải ly chảy ngang qua cột. Lượng dung mơi có thí tích bằng 2-3 lđn thể tích cột, tốc độ chảy có thể nhanh hơn một ít so với khi thực nghiệm thực sự.
Tiếp theo cột được kiểm tra bằng câch cho một lượng mẩu kiểm tra, thường lă Dextran Blue 2000 văo đầu cột. Thể tích dung dịch mẫu <105 thể tích cột. Cho dung mơi giải ly để đuổi hoăn toăn lượng mẫu ra khỏi cột: mẫu có mù xanh dương nín có thí theo dõi bằng măt thường. Níu cột được nhồi một câch chặt chẽ vă đều đặn thì mẫu kiím tra ra khỏi cột bang một dêy hẹp nằm ngang.
Câch thử năy cũng dùng để đo thể tích trống Vo của cột (void volume). Vo lă thể tích dung mơi cần thiết để đuổi một hợp chất mău (không bị giữ lại trong gel) ra khởi cột sắc ký.
Lưu ý: trong suốt quâ trình nạp gel cũng như trong q trình triín khai săc ký, khơng được đí khơ lớp mặt gel trín đđu cột.
Chuẩn bị niẫu để sắc kỷ
Dung dịch mẫu cđn được loại bở những hợp chđt còn ở dạng răn cũng như những phđn từ có thí bị hấp thu mạnh mẽ lín bề mặt gel.
Khối lượng mẫu vă nồng độ của những chất tan có trong mẫu chỉ quan trọng khi chúng có ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch mẫu. Níu độ nhớt của mẫu cao hơn 2 lan độ nhớt của dung mơi giải ly thì có thí ảnh hưởng đến kết quả tâch chất.
Thể tích dung dịch mẫu cũng quan trọng. Thể tích lớn nhất có thể sử dụng lă (Vci-Vc2); với Vei vă Vc2 lă thể tích để lần lượt giải ly 2 hợp chất có đặc điểm gần giống nhau nhất. Với những loại mẫu mă (Vei-Ve2) lớn,
thể tích dung dịch mẫu có thể chiếm 10-30% tổng thể tích cột gel (Vt). Với những dung dịch mẫu mă (Vei-Ve?) nhỏ, thể tích dung dịch mẫu chỉ nín lă
1 -3% của thể tích Vt.
Dung dịch mẫu cần được hòa tan văo dụng dịch đệm. Đặt dung dịch mẫu lín đầu cột giống như khi thực hănh trong cột silica gel cổ điển. Giải ly cột có the bằng trọng lực hoặc bằng bơm đẩy.
Triển khai giải ly rất đơn giản, chỉ sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nông độ. Câc chất tan sẽ ra khởi cột theo thứ tự trọng lượng phđn từ giảm dần.
3.5.4.2. Chuđn bị cột săc kỷ gel Sephadex LH-20
Ke từ năm 1959, sắc ký gel đê được âp dụng nhiều trong ngănh sinh hóa đí tâch câc họp chất có trọng lượng phđn tử lớn như polysaccharid hay protein. Trong ngănh hóa học hữu cơ, câc chất cần phđn tâch thường có trọng lượng phđn tử nhỏ, ít khi dùng kỹ thuật sac ký gel năy, mă thường dùng sâc ký gel đe loại muối với gel Sephadex LH-20 hoặc Sephadex G-15.
Kích thước của cột: Chọn cột thủy tinh có đường kính từ 1,5-2,5 cm;
chiều dăi từ 40-100 cm. Kích thước cột được điều chỉnh tùy văo thí tích gel sử dụng.
Lượng mau vă lượng gel: trung bình với 1 mg mẫu họp chđt cđn săc
ký, cần 1 mL gel đê trương nở.
Cho trương nở gel: Trong một erlen hoặc một becher, cho gel khô
Sephadex LH-20 văo, cho một lượng dung môi methanol vừa đủ, đí yín qua đím cho gel trương nỏ’. Quan sât nếu cần thiết thì cho thím methanol văo sao cho dung dịch hun phù gel tuy sệt nhưng có thí chảy được thănh dịng.
Gel Sephadex LH-20 có thể ngđm trong câc dung mơi hữu cơ để cho trương nở theo bảng 21
Nạp gel văo cột: Sử dụng cột thủy tinh, đầu ra có chặn bằng thủy tinh
xốp đí gel không bị chảy ra khỏi cột, cột được dựng thắng đứng trín một giâ, mở một phần khóa ở đầu ra. Rót dung dịch huyền phù gel văo cột, dung mơi chảy ra ỏ’ đầu dưới cột. Rót dung dịch gel văo cột thănh một dòng nhỏ, đều, chậm chậm sao cho chỉ rót một lần lă hết lượng gel (đí tạo thănh một khối gel đồng đều vă chặt chẽ), trânh rót thănh nhiều đợt. Có thể gõ nhẹ bín ngoăi thănh cột để cho gel được nĩn đều.
Bảng 3.19. Thể tích gel Sephadex trương nở trong câc loại dung môi
Dung môi Luong dung môi
hap thu (mL/g) Thể tích gel (mL/g) D i methy Ifofnam i de 2.2 4.0-4.5 Nước 2.1 4.0-4.5 Methanol 1.9 4.0-4.5 Ethanol 1.8 3.5-45 Chloroform (1% ethanol) 1.8 3.5-4.5 Chloroform 1.6 3.0-3.5 n-Butanol 1.6 3.0-3.5 Tetrahydro furan 1.4 3.0-3.5 Acetone 0.8 - Acetate ethyl 0.4 - Toluene 0.2 -
Cđn bằng cột gel: Khi nạp cột xong, tiếp tục cho dung môi như
methanol chảy ngang qua cột với vận tốc 1-5 mL/phút de gel cđn băng với methanol.
Luong dung mơi hịa tan mẫu: Mau được hịa tan trong dung mơi
methanol
- Neu mục đích sac ký lă đe tâch riíng câc họp chất thì lượng dung mơi lă 1 -5% thể tích cột gel. Thí dụ nếu thề tích cột gel lă 200 mL thì lượng dung mơi hịa tan mẫu lă 10 mL.
- Nếu mục đích sắc ký lă loại muối thì lượng dung mơi có thế đến 30% thể tích cột gel.
Nạp mẫu văo đầu cột: Mở khóa đế hạ mức dung mơi xuống gần sât
mặt thông gel trín đầu cột, sử dụng pipet đí đưa dung dịch mẫu lín đđu cột gel. Mở khóa đế dung mơi chảy ra khởi cột đến khi mức dung môi xuống sât mặt thơng gel trín đầu cột, khóa cột lại, cho thím một ít methanol văo, mở’ khóa để dung mơi chảy ra. Lăm như thế nhiều lan đí cho dung dịch mẫu thấm sđu văo lớp gel trín đầu cột. Đen khi băt đđu giải ly, mẫu khơng hịa tan trở lại dung môi giải ly.
Giải ly cột: Cho dung môi văo đầy phần trín đầu cột vă mở’ khóa bín
Có thể giải lỵ bằng trọng lực, vận tốc từ 10-15 cm/giờ.
Tốt nhất lă có thể sử dụng mây bơm đấy khí trín đầu cột vì có thí điều chỉnh được vận tốc 2-4 mL/phút.
3.5.5. Câc ừng dụng của kỹ thuật sắc kỷ geỉ ...
Một trong những ưu điềm chính của sắc ký lọc gel lă sự phđn tâch có thể được thực hiện trong câc điều kiện được thiết kế đặc biệt đế duy trì sự ổn định vă hoạt động của phđn tử quan tđm mă không ảnh hưởng đến độ phđn giải. Bín cạnh đó, nó cũng có một văi nhược diím. Ví dụ. khi tâch protein bằng sâc ký lọc gel. quâ trình phđn giải protein trở thănh một vđn đề ngăy căng gia tăng, vì protein đích thường xun trở thănh cơ chat dơi dăo cho câc protease cũng có trong hỗn hợp, do đó lăm giảm hoạt tính thu hồi. Do kích thước lớn của cột lọc gel, nín thường u cầu khơi lượng lớn dung dịch rửa giải, thường tạo ra chi phí lớn. Lọc gel cũng có độ phđn giải
vấu có. S.Q với câc kỹ thuật sắc ký khâc. Ngoăi ra, kỹ thuật năy có kha năng xử lý mẫu thấp do nhu cấu tịi ưu hóa độ phđn gíả. Tuy nftfen, sac ẳý lọc gel vẫn chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực tâch phđn tử sinh học vì tính đơn giản, độ tin cậy, tính linh hoạt vă dễ mở rộng quy mô.
3.5.5. ỉ. Tâch một hỏn hợp thănh câc nhóm chất riíng lỉ
Âp dụng đơn giản nhất của sắc ký gel lă tâch 2 nhóm hợp chất tan có kích thước khâc xa nhau. Neu chọn được loại gel thích hợp, họp chất có khối lượng phđn tử lớn sẽ bị đuổi hoăn toăn ra khỏi cột gel, thường bị đuối ra khỏi cột ngay từ thể tích trống Vo. Cịn hợp chất có khối lượng phđn tử nhỏ sẽ bị giữ chặt trong cột vă bị đuối ra sau.
Thí dụ: trong q trình chuyển dối hóa học, câc họp chat protein có trọng lượng phđn tử 10’11 sẽ sinh ra câc phụ phăm có trọng lượng phđn tử nhỏ hơn như urí. đường, peptide... Câc phụ phăm năy được loại bở ra khởi sản phăm có trọng lượng phđn tử lớn băng săc ký gel.
3.5.5.2. Xâc định trọng lượng phđn tử cú a một hợp chất cỏ trọng lượng phân tử lớn
Đầu tiín, sắc ký gel được sử dụng đế tâch câc đại phđn tử có nguồn gốc sinh học như: polysaccharide, protein, acid nucleic vă enzyme. Câc quan sât thay rang câc hợp chất bị đuổi ra khởi cột theo thứ tự trọng lượng
Câch thực hiện: Cột gel được sắc ký lần lượt bởi nhiều hợp chất cùng
chủng loại có trọng lượng phđn tử đê biết, vẽ đường biểu diễn mối quan hệ giữa thể tích giải ly vă trọng lượng phđn tử. Với một hợp chất bđt kỳ, nạp văo cột vă giải lỵ ra khỏi cột để biết được thế tích giải ly. Nhờ văo đường chuẩn để suy ra được trọng lượng phđn tử của chất đó. cần cơ găng chọn chất chuẩn có cấu trúc hóa học tương đồng với chất cần xâc định trọng lượng phđn tử.
Câc nhă sản xuất thường có nhiều bộ chất chuẩn, tùy thuộc văo hợp chất cần xâc định mă chọn bộ chất chuẩn thích hợp. Một số bộ chất chuẩn thương mại lă protein được trình băy trong bảng 3.20.
Bảng 3.20. Một số protein được sử dụng lăm chất chuẩn để đo trọng
lượng phđn tử
TT Protein Trọng lưọng phđn tủ’
1 Cytochrom c 13.000
2 Ribonuclease A 13.700
3 Myoglobin 17.800
4 Inhibiteur de trypsin (soja) 21.500
5 cc-Chymotrypsin 22.500
6 Trypsin 24.000
7 Chimotrypsinogene A 25.000
8 Pepsine 35.500
9 Ovalbumine 43.000
10 Bovine serum albumine
(monomer) 67.000 11 Dĩshydrogĩnase du phosphat de 1'aldehyde glycerique 117.000 12' Bovine serum albumine(dimere) 134.000 13 y-globuline (người) 140.000 14 Alcool dĩshydrogĩnase (levure) 150.000 15 Aldolase (levure) 158.000 16 Catalase 230.000
Thí dụ, để đo trọng lượng phđn tử của hợp chất Poly (A) polymerase, sử dụng gel Sephacryl S-200 với bộ chất chuẩn gồm những protein lă: aldolase (M=l 58.000), BSA monomer (M=67.000), ovalbumine (MM3.000), Chymotrypsinogene A (M=25.000) vă ribonuclease (M= 13.700), có được đường biểu diễn như hình 3.10.
Đường biếu diễn mối liín hệ giữa trọng lượng phđn tử của bộ mẫu chuẩn