BẢNG THU MẪU THỤC VẬT
Mau thu
LJ Mau mới
□ Mầu thu lại Ký hiệu mẫu:.......... Ngăy:............................................................ Ghi chú:.........................................................
Ngi thu mẫu:
Ví trí thu mẫu (GPS): Chiều dăi (m):
Môi trường sống:
Sự phổ biến: □ Phổ biến □ Bình thường □ Hiếm gặp □ Rất hiếm gặp Khối lượng (kg):
Hình thâi học: □ Rễ:
HÌNH DẠNG BÍN NGOĂI
Mău sắc: Bín ngoăi:....... ........ Bín trong:................
n Thđn: □ Lâ: □ Hoa: □ Quả: □ Hạt:
Câc ghi chú khâc:
“Bảng thu mẫu của nhỏm nghiín cửu của GS. TS. Trần Đình Thắng, Trường Đại học Công nghiệp TPHCM, Thănh phố Hồ Chỉ Minh.
4.3.2. Câc kỹ thuật chiết tâch
Chiết tâch lă bước đầu tiín trong q trình nghiín cứu dược phẩm có nguồn gốc từ thực vật. Một số quỵ trình chung đê được đề xuất đí thu được dịch chiết cho câc hợp chất phđn cực, lăm giău của câc hợp chất chun hóa bậc hai phơ biến nhất như alkaloid vă saponin.
Ngoăi câc phương phâp truyền thống, như ngấm kiệt, ngđm đầm vă chưng cất lôi cuốn hơi nước, một lo.ạt câc kỹ thuật hiện đại đê được giói thiệu trong những thập kỷ qua. Chúng bao gồm chiết tâch bằng vi sóng (MAE), chiết tâch hỗ trợ siíu đm (ƯAE), chiết tâch chất lỏng siíu tới hạn (SFE) vă chiết tâch long điều âp (PLE).
Trong chiết tâch bằng vi sóng (MAE), lị vi sóng được kết hợp với chiết tâch dung mơi truyền thống; Hệ thống lăm nóng năy có thí lăm tăng sự thđm nhập của chất tan trong mẫu thực vật thúc đẩy q trình hịa tan câc hợp chất có hoạt tính sinh học. Tương tự, chiết tâch hỗ trợ siíu đm (ƯAE). sóng siíu'đm phâ vỡ thănh tế băo thúc đđy sự giải phóng câc sản phẩm tự nhiín có hoạt tính sinh học văo trong dung môi. So sânh giừa MAE, ƯAE vă câc phương phâp thơng thường cho thđy những ưu diím của MAE vă ƯAE chính lă thời gian chiết tâch ngan hơn vă hiệu suất chiết tâch câc thănh phần hoạt tính sinh học cao hơn. Những tiến bộ gần đđy trong việc phât triển câc kỹ thuật MAE đê tạo điều kiện cho câc nhă khoa học thím sự lựa chọn hiệu quả cho quâ trình chiết tâch như: MAE cao âp (EIPMAE), MAE trong bầu khơng khí Nitơ (NPMAE), MAE chđn khơng (VMAE), MAE siíu đm (ƯMAE), MAE khơng dung môi (MAF) vă MAE động (DMAE).
4.3.2.1. Lựa chọn dung môi
Câc yếu tố cần được xem xĩt khi lựa chọn dung môi hoặc hệ dung môi đế chiết tâch câc họp chất có nguồn gốc từ thực vật bao gồm độ tan của câc họp chất cần phđn lập; độ an toăn, dễ lăm việc với dung môi; mức độ tinh khiít cùa dung mơi.
Theo ngun tắc, sự lựa chọn dung mơi nhằm tối đa hóa chiết tâch câc hợp chất có hoạt tính cần quan tđm, trong khi giảm thiểu sự trích ly câc hợp chất khơng mong muốn. Việc nghiín cứu kỹ lưỡng câc tăi liệu liín quan đến câc loăi thực vật vă câc loại họp chất dang được tiến hănh nghiín cứu sẽ giúp tiết kiệm thời gian vă cơng sức. Ngay cả khi có ít thơng tin ví câc chất chuyển hóa bậc hai từ một loăi đặc biệt, thì câc cơng bố về hóa thực vật trín câc loăi khâc trong cùng chi hoặc họ cũng có thí cung cđp những thơng tin về câc loại hợp chất mong muốn vă câc dung mơi, quy trình năo có thí dược sử dụng đe phđn lập chúng.
Dung mơi có điểm sơi thấp nói chung dễ sử dụng hơn như acetone, chloroform (CHCI3), dichloromethan (DCM), ethyl acetate (EtOAc) vă n- hexane/ ether dầu hỏa bay hơi tương đối nhanh, trong khi nước vă butanol lại khó loại bỏ hơn trong q trình chiít tâch.
4.3.2.2. Chuđn bị dịch chiết săng lọc hoạt tính sinh học
Khi chiết tâch một lượng lớn dịch chiết có nguồn gốc thực vật với chỉ một hệ thống dung môi phù họp lă khơng khả thi. Quy trình chung tạo dịch chiết phải được xđy dựng vă xem xĩt nhăm thu đuợc câc dịch chiít
có hoạt tính sinh học băng câch sử dụng phối họp câc phương phâp chiết tâch.
Quy trình tạo dịch chiết phục vụ săng lọc hoạt tính
Câc mẫu thực vật được chiết theo quy trình.sau:
Bước ỉ: Chuấn bị mẫu: câc mẫu thực vật được sấy khô hoặc phơi khô. Bước 2: Cđn lượng mẫu thu được vă xay mẫu (tùy theo loại mẫu thực
vật: lâ. thđn hoặc rễ sử dụng câc thiết bị xay vă nghiền mẫu khâc nhau).
Bước 3: Mầu thực vật đê xay được tiến hănh chiết 3 lần bằng dung mơi
thích hợp (MeOH, EtOH...) bằng câc phương phâp chiít tâch thích hợp, ở nhiệt độ, thời gian thích họp.
Bước 4: Dịch chiết của 3 lần chiết được lọc qua giấy lọc, gộp lại vă tiến
hănh cất loại dung môi dưới âp suất giảm ở nhiệt độ thấp thu được dịch cô.
Câch đânh số kỷ hiệu mẫu thô: Ký hiệu mẫu thô = Ký hiệu mđu + kỷ hiệu dung mơi. Trong đó, Dung mơi MeOH (Kỷ hiệu 00); Dung môi n- Hexane (01); Dung môi Chlor of om (Kỷ hiệu 02); Dung môi Butanol (Ký hiệu 03),...
Ví dụ: Mau Khúng khĩng Hovenia dulcis (Rhamnaceae) TĐ6 chiít
bằng dung mơi MeOH được ký hiệu TĐ6.00.
Bước 5: Cđn dịch chiết vă tính lượng cặn dịch chiết phần trăm hiệu suất. Bước 6: Mầu được gửi đi thử hoạt tính vă một lượng vừa đủ được bảo
quản trong câc lọ đựng cặn dịch chiết (theo tiíu chuẩn bảo quản mẫu) trong tù lưu trữ mẫu (-20°C) lăm đối chứng.
Mau thực vật
1. Ngđm với MeOH 2. Cò dung mòi âp suêt thđp
Dịch chiết MeOH
1. Trộn với MeOH 90° ù
2. Cliiẻt phản đoạn vói Hexan 110 ạc petroleum ether
n., vr„r\ĩr ■ Dịch chief
Dịch chief MeOH 9O°o * Hexane
1 . Trộn với nước
2 Cliiẻt phđn đoạn với CHC13
Dịch chỉẻt
CHCb
Dịch chief Nước
1 . Loại bo tannins băng dd NaCl 1 ° 0 2 Sấy khỏ
Dịch chief CHCb
(killing chứa Tannins)
Dung dịch
Na Cl 19 0 (loại
bị)
Hình 4.2. Quy trình chung tạo dịch chiết CHCI3 khơng chứa tannin.
4.3.2.3. Lăm giăn dịch chief
Sau khi xâc định chính xâc thănh phần hóa học hoặc một lớp chất có nguồn gơc từ thực vật lăm mục tiíu nghiín cứu, câc quy trình chiết tâch đặc biệt có thí được sử dụng để lăm giău dịch chiết có chứa câc hợp chất năy. Trong một số trường hợp, độ phđn cực của dung mơi có thế dược sử dụng đí lăm câc lớp chất cần nghiín cứu kết tủa vă được lọc thu hồi một câch nhanh chóng, cịn câc hợp chất không mong muốn sẽ bị giữ lại trong dung dịch. Câc hợp chất có chứa câc nhóm amin bậc nhất, bậc hai vă bậc ba, acid carboxylic, lactone vă phenol có thể được chiết tâch bằng câch sử dụng sự thay đổi giâ trị pH nhằm điều chỉnh độ phđn cực hoặc độ tan của câc hợp chất cần chiết tâch.
Mđu thực vật
I Delhi w ill) hexane or
petroleum ether
Bă rau
Chiết với Xie OH
(hay EtOH hay EtOH nước)
Dịch chiết
Hexane hoặc
Petroleum Ether
(chứa bĩo. sap. vê
chlorophylls)
Dịch chiết Bă răn MeOH
1. Trộn với nước
2. Chiết phđn đoạn VỚI n-butanol
Dịch chiẻt u-Butanol Phđn đoạn nước
Bô sung diethyl ether thu hon hợp saponin mixture
Saponin thó
Hình 4.3. Quy trình chung chiết tâch saponin thơ từ thực vật.
Hình 4.3 cho thấy một quy trình chiết tâch hỗn hợp saponin thơ (steroidal hoặc triterpene glycoside). Mẩu nguyín liệu thực vật được loại câc chất bĩo bằng dung môi n-hexane vă chiết bằng MeOH. Dịch chiết MeOH được cô trong điều kiện chđn khơng, sau đó hịa tan lại bang nước cất deion vă tiến hănh chiết phđn đoạn với dung môi n-butanol. Diethyl ether được thím văo phđn đoạn butanol đế thu được phđn kít tủa, lọc kít tủa chính lă phần saponin thô.
Chiết tâch chọn lọc vă phđn đoạn câc sterol thực vật (bao gôm sapogenin, bufadienolide vă glycoside) cũng được tiến hănh tương tự thông qua việc sử dụng câc phương phâp hóa học vă dung mơi. Câc hợp chất khơng chứa nhóm alcohol có thể được tâch ra từ câc alcohol bằng
phthalate, câc alcohol có thể được tâi tạo lại bằng câch xử lý với natri methoxide trong MeOH. Câc sterol có chứa nhóm ketone có the được tâch ra khỏi câc phđn đoạn không chứa ketone bằng câch chiết chúng thông qua câc dung môi hữu cơ vă dung dịch Girard (H2N.NH.CO.CH2.NR3 +C1") vă câc ketone có- the được tâi tạo bang thủy phđn acid.
Câc alkaloid có chứa câc amin bậc nhất có thí đưọ'c trích chọn lọc băng câch sử dụng quy trình thay đồi so với với phương phâp co dien "acid-base shakeout" (hình 4.4). cần loại bở câc acid vô cơ vă câc base mạnh trong quâ trình chiết tâch alkaloid (vă ngun liệu thực vật nói chung) do nguy CO’ tạo ra artifact. Câc quy trình chiết tâch alkaloid sử dụng acid tartaric vă Na2CƠ3 để điều chinh độ pH trong quâ trình chiết tâch. Đầu tiín, pH được điều chính đến giâ trị pKa < 2 của câc amin bậc nhất khiến chúng dễ dăng hình thănh câc dạng muối vă do đó dễ dăng bị phđn bố văo nước (cùng với câc thănh phần phđn cực, bao gồm amin bậc bốn vă alkaloid ỳV-oxide). Câc họp chất không phđn cực sẽ bị giữ lại trong pha dung môi hữu cơ. Sau khi loại bở lớp dung môi hữu cơ, dịch nước thu được tiếp tục tiến hănh tạo câc ra dạng base tự do của alkaloid bậc nhất. Tiếp tục cho dung môi hữu cơ mới văo dịch nước, câc alkaloid phđn bố văo lóp dung mơi hữu cơ, tạo ra một phần alkaloid gần như tinh khiết, ngoại trù' câc A^-oxide vă câc amin bậc bốn vẫn còn trong dịch nước. Sơ đồ chiết tâch cũng có thí thay đơi bằng câch sử dụng một loạt câc bước phđn tâch với sự tăng dần tính acid tạo nín một gradient pH nhằm chiết tâch câc họp chất trung tính (hoặc có tính acid trung bình) thănh câc alkaloid. Câc alkaloid cũng có thể được chiết tâch bằng dung dịch acid acetic 10% trong EtOH, sau đó được cơ trong điều kiện chđn khơng tới một phần tư thế tích ban đầu vă lượng kết tủa của phần alkaloid thơ được thím dung dịch NH4OH. Ngoăi ra, nguyín liệu thực vật trước tiín cũng có thể được ngđm với một base pha loêng (NaHCƠ3, Na2CƠ3, hoặc dung dịch CaCCh), sau đó lă ngđm dầm hoặc ngấm kiệt với dung môi hữu cơ không phđn cực.
Mau thực vật
1. Loại bĩo bang Hexane hoặc petroleum ether
2. Chiết với MeOH. lọc: co
Dịch chiết MeOH
loại bẽo
1. Trộn với axit tartaric pH=5
2. Cliiít phđn đoạn với EtOAc
Pha dung dịch acid Phản đoạn Ethyl acetate
1. Tạo Alkaline với dung
dịch Na.? po 3 pH =11
2. Chiẻt phân đoạn với EtOAc
Dịch nước Phđn đoạn Ethyl acetate (chửa amine bậc 4, , . ____ • 1 1 1 11
17 1.1 7- .; (chưa amin bạc 1,2,3) alkaloid N-oxides
Hình 4.4. Quy trình chung chiết tâch alkaloid từ thực vật.
Hầu hết câc hợp chất có chứa nhóm chức acid carboxylic có tính ưa bĩo trong dung mơi acid vă có tính ưa nước trong dung mơi cơ bản khâc, mặc dù mức độ ưa bĩo hay ưa nước phụ thuộc văo bản chất của phđn còn lại của phđn tử. 7 ương tự như vậy, câc polyphenol thường có the dược loại bở bằng câch chiết giữa dung môi hữu CO' với dung dịch nước (khoảng pH 12.0). Dung dịch kiềm cũng lăm tăng tính chất ưa nước của câc flavonoid aglycone chứa câc nhóm phenol tự do. Một phương phâp để chiết tâch câc flavonoid phđn cực vă câc anthocyanin từ lâ hoặc hoa lă nghiín nguyín liệu tươi trong dung dịch HC1 1% trong MeOH.
4.3.3. Câc kỹ thuật phđn lập
1) Kỹ thuật sắc ký cơ điín gồm:
- Sắc ký bản mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography)
Sắc ký bản mỏng điều chế (PTLC - Preparative Thin Layer Chromatography)
Sắc ký cột (CC - Column Chromatography) Sắc ký nhanh (FC - Flash Chromatography)
2) Kỹ thuật sâc ký hiện, đại gồm:
Sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
sâc ký nhanh đa chức năng (Multiílash Chromatography)
Sắc ký lỏng chđn khơng (VLC- Vacuum Liquid Chromatography)
Chiết pha rắn (SPE- Solid Phase Extraction)
Sắc ký nhỏ giọt ngược dòng (DCCC - Droplet Counter-Current Chromatography)
Sắc ký long hiệu năng cao (HPLC-Hỉgh Perfomance Liquid Chromatography)
Câc kỹ thuật ghĩp nối thiết bị (HPLC-PDA; LC-MS; LC-NMR; LC-MS-NMR...)
Câc phương phâp sắc ký năy được lựa chọn tùy văo từng đối tượng hợp chất cụ thể, điều kiện cụ thể để có thể thiết lập được một phương phâp phđn lập hiệu quả tơt nhđt.
4.4. Phđn lập một số họp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tù’ thực vật thực vật
4.4.1. Alkaloid
Câc alkaloid lă một nhóm lớn của câc chuyển hơ thứ cấp chứa ngun tử nitơ có trong thực vật, vi khuẩn, nguồn gốc động vật. Cho đến nay, hăng loạt câc kỹ thuật kết nối được dùng trong phđn tích nhiều loại họp chất alkaloid. Nhiều hệ thống thiết bị mây dự phịng có sẵn vă cải tiến, trong đó GC-MS trở thănh phương phâp được chọn đí phđn tích hăng loạt dạng hợp chất thuộc alkaloid như pyrrolizidine vă quinolizidine. Alkaloid quinolizidine lă loại alkaloid được tìm thấy trong họ Đậu (Leguminosae)
mă gần đđy đê được phđn tích băng GC-MS. Hđu hết câc alkaloid năy rđt dễ bay hơi vă bền với nhiệt dưới câc điều kiện GC để cho phĩp phđn tích mă khơng lăm thay đổi bản chất hô học. Tuy nhiín, một văi alkaloid pyrrolizidine được hidroxyl hô cần được phđn tích như một dẫn xuất trimethylsilyl của chúng. Alkaloid dạng ephedrine dùng lăm câc chất bô sung vảo chế độ ăn uống chứa trong thảo dược được phđn tích bằng GC- MS vă GC-FTIR.
Một số chất chuyển hoâ protoberberine khâc về sổ lượng vă vị trí câc nhóm có khả năng oxi hơ trín vịng thơm được xâc định trước khi phđn lập từ câc tế băo Corydalis bằng LC-MS vă LC-NMR. Nghiện cứu năy chứng minh câc giâ thiết ban đầu về con đường sinh tổng họp để hình thănh câc alkaloid năy, đặc biệt, con đường chuyển hoâ tạo oxi hô 2,3,10,11 tetrahydroprotoberberine trong câc tế băo ni cấy. Thiết bị APCI được sử dụng trong hệ thống LC-MS vă khối phổ được tiến hănh với sự định lượng ion đê được chọn (SIM) vă định lượng tống ion (TIM) bằng chế độ quĩt ion dương. Thông tin về ion phđn tử thu được từ ion phđn tử được proton hô IM+HI; hoặc chùm ion [M+HCF.3]+. Bộ phđn tích LC-NMR được thực hiện trín mây phổ kế Varian UNITY-INOVA-500 được trang bị với đầu dò giân tiếp PFG vă đầu dò LC-NMR với tốc độ dòng 60 pL, sử dụng chế độ dòng chảy dừng. Hoạt động của LC được thực hiện trín cột pha đảo Cosmosil 5 C18-AR (4,6 X 150 mm) sử dụng pha động lă hỗn hợp gồm dung môi A = O,1M NITịOAc (0,05% TAF) vă dung mơi B = ACN. u cầu dung dịch rửa giải với tỉ lệ tăng dần được tuđn theo như sau: 20-30% B trong 10 phút, 30% B khảng 10 phút vă 30-155% B trong 10 phút, tốc độ dòng 1 mL/phút, phât hiện ở 280 nm.
4.4.2. Coumarin
Coumarin lă nhóm họp chất lớn nhất của câc dẫn xuất 1-benzopyran được tìm thấy chủ yếu ở thực vật bậc cao. HPLC-PDA có thể được sử dụng đế phđn tích nhiều họp chat phenolic rất thănh công, bao gồm câc coumarin, bởi sự hiện diện một lượng đâng kí câc nhóm mang mău trong phđn tử. Xâc định coumarin qua thiết bị HPLC-PDA, tại đđy phổ hấp thụ được ghi với đầu dò PDA, cung cấp câc thơng tin hữu ích về việc xâc định câc phđn tử năy bao gồm câc mẫu oxi hoâ. Thời gian lưu cùng với câc peak riíng lẽ trín phơ ƯV được xem lă đặc trưng vă có thể được sử dụng đế
dăng. Sự kết kết nối giữa MS vă LC-PDA đê cung cấp nhiều thông tin về cấu trúc, điều năy giúp cho việc xâc định trực tuyến từng coumarin riíng lẻ trong bất kỳ dịch chiết thô năo. Hăng loạt coumarin cùng với câc hợp chất dị vòng chứa oxi như: psoralen vă câc ílavon được polymethyl hô có mặt trong phần cặn’không bay hơi của tinh dầu từ cam quýt của quýt, cam mật, cam chua, cam bergamot, bưởi được phđn tích bang hệ thống LC-MS ion hô dưới âp suất khí quyển (API) vă được trang bị đầu dị APCI với chế độ quĩt ion dương. Việc ghi phổ MS câc chất dễ bay hơi cung cấp câc thông tin về khối lượng phđn tử cùng với câc ion phđn mảnh vă nhờ đó mă cho phĩp xâc định câc họp phần chủ yếu trong dịch chiết. Trong nghiín cứu năy, tinh dầu câc loại cam quýt được ĩp nguội được phđn tích băng hệ thống LC Shimadzu kết nối với detector ƯV vă MS với kết nối với APCI. Q trình tâch bằng LC được thực hiện trín cột c 18 Pinnacle (250 X 4,6 mm, 5pL), dung dịch rửa giải đồng nhất hoặc sử dụng hỗn họp dung môi độ phđn cực tăng dần với tốc độ dịng ImL/phút: dung mơi A