Hầu hết câc hợp chất có chứa nhóm chức acid carboxylic có tính ưa bĩo trong dung mơi acid vă có tính ưa nước trong dung mơi cơ bản khâc, mặc dù mức độ ưa bĩo hay ưa nước phụ thuộc văo bản chất của phđn còn lại của phđn tử. 7 ương tự như vậy, câc polyphenol thường có the dược loại bở bằng câch chiết giữa dung môi hữu CO' với dung dịch nước (khoảng pH 12.0). Dung dịch kiềm cũng lăm tăng tính chất ưa nước của câc flavonoid aglycone chứa câc nhóm phenol tự do. Một phương phâp để chiết tâch câc flavonoid phđn cực vă câc anthocyanin từ lâ hoặc hoa lă nghiín nguyín liệu tươi trong dung dịch HC1 1% trong MeOH.
4.3.3. Câc kỹ thuật phđn lập
1) Kỹ thuật sắc ký cơ điín gồm:
- Sắc ký bản mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography)
Sắc ký bản mỏng điều chế (PTLC - Preparative Thin Layer Chromatography)
Sắc ký cột (CC - Column Chromatography) Sắc ký nhanh (FC - Flash Chromatography)
2) Kỹ thuật sâc ký hiện, đại gồm:
Sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC)
sâc ký nhanh đa chức năng (Multiílash Chromatography)
Sắc ký lỏng chđn khơng (VLC- Vacuum Liquid Chromatography)
Chiết pha rắn (SPE- Solid Phase Extraction)
Sắc ký nhỏ giọt ngược dòng (DCCC - Droplet Counter-Current Chromatography)
Sắc ký long hiệu năng cao (HPLC-Hỉgh Perfomance Liquid Chromatography)
Câc kỹ thuật ghĩp nối thiết bị (HPLC-PDA; LC-MS; LC-NMR; LC-MS-NMR...)
Câc phương phâp sắc ký năy được lựa chọn tùy văo từng đối tượng hợp chất cụ thể, điều kiện cụ thể để có thể thiết lập được một phương phâp phđn lập hiệu quả tôt nhđt.
4.4. Phđn lập một số họp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tù’ thực vật thực vật
4.4.1. Alkaloid
Câc alkaloid lă một nhóm lớn của câc chuyển hô thứ cấp chứa ngun tử nitơ có trong thực vật, vi khuẩn, nguồn gốc động vật. Cho đến nay, hăng loạt câc kỹ thuật kết nối được dùng trong phđn tích nhiều loại họp chất alkaloid. Nhiều hệ thống thiết bị mây dự phịng có sẵn vă cải tiến, trong đó GC-MS trở thănh phương phâp được chọn đí phđn tích hăng loạt dạng hợp chất thuộc alkaloid như pyrrolizidine vă quinolizidine. Alkaloid quinolizidine lă loại alkaloid được tìm thấy trong họ Đậu (Leguminosae)
mă gần đđy đê được phđn tích băng GC-MS. Hđu hết câc alkaloid năy rđt dễ bay hơi vă bền với nhiệt dưới câc điều kiện GC để cho phĩp phđn tích mă khơng lăm thay đổi bản chất hô học. Tuy nhiín, một văi alkaloid pyrrolizidine được hidroxyl hô cần được phđn tích như một dẫn xuất trimethylsilyl của chúng. Alkaloid dạng ephedrine dùng lăm câc chất bô sung vảo chế độ ăn uống chứa trong thảo dược được phđn tích bằng GC- MS vă GC-FTIR.
Một số chất chuyển hoâ protoberberine khâc về sổ lượng vă vị trí câc nhóm có khả năng oxi hơ trín vịng thơm được xâc định trước khi phđn lập từ câc tế băo Corydalis bằng LC-MS vă LC-NMR. Nghiện cứu năy chứng minh câc giâ thiết ban đầu về con đường sinh tổng họp để hình thănh câc alkaloid năy, đặc biệt, con đường chuyển hoâ tạo oxi hoâ 2,3,10,11 tetrahydroprotoberberine trong câc tế băo nuôi cấy. Thiết bị APCI được sử dụng trong hệ thống LC-MS vă khối phổ được tiến hănh với sự định lượng ion đê được chọn (SIM) vă định lượng tống ion (TIM) bằng chế độ quĩt ion dương. Thông tin về ion phđn tử thu được từ ion phđn tử được proton hoâ IM+HI; hoặc chùm ion [M+HCF.3]+. Bộ phđn tích LC-NMR được thực hiện trín mây phổ kế Varian UNITY-INOVA-500 được trang bị với đầu dò giân tiếp PFG vă đầu dò LC-NMR với tốc độ dòng 60 pL, sử dụng chế độ dòng chảy dừng. Hoạt động của LC được thực hiện trín cột pha đảo Cosmosil 5 C18-AR (4,6 X 150 mm) sử dụng pha động lă hỗn hợp gồm dung môi A = O,1M NITịOAc (0,05% TAF) vă dung mơi B = ACN. u cầu dung dịch rửa giải với tỉ lệ tăng dần được tuđn theo như sau: 20-30% B trong 10 phút, 30% B khảng 10 phút vă 30-155% B trong 10 phút, tốc độ dòng 1 mL/phút, phât hiện ở 280 nm.
4.4.2. Coumarin
Coumarin lă nhóm họp chất lớn nhất của câc dẫn xuất 1-benzopyran được tìm thấy chủ yếu ở thực vật bậc cao. HPLC-PDA có thể được sử dụng đế phđn tích nhiều họp chat phenolic rất thănh cơng, bao gồm câc coumarin, bởi sự hiện diện một lượng đâng kí câc nhóm mang mău trong phđn tử. Xâc định coumarin qua thiết bị HPLC-PDA, tại đđy phổ hấp thụ được ghi với đầu dò PDA, cung cấp câc thơng tin hữu ích về việc xâc định câc phđn tử năy bao gồm câc mẫu oxi hoâ. Thời gian lưu cùng với câc peak riíng lẽ trín phơ ƯV được xem lă đặc trưng vă có thể được sử dụng đế
dăng. Sự kết kết nối giữa MS vă LC-PDA đê cung cấp nhiều thông tin về cấu trúc, điều năy giúp cho việc xâc định trực tuyến từng coumarin riíng lẻ trong bất kỳ dịch chiết thơ năo. Hăng loạt coumarin cùng với câc hợp chất dị vòng chứa oxi như: psoralen vă câc ílavon được polymethyl hô có mặt trong phần cặn’không bay hơi của tinh dầu từ cam quýt của quýt, cam mật, cam chua, cam bergamot, bưởi được phđn tích bang hệ thống LC-MS ion hô dưới âp suất khí quyển (API) vă được trang bị đầu dò APCI với chế độ quĩt ion dương. Việc ghi phổ MS câc chất dễ bay hơi cung cấp câc thông tin về khối lượng phđn tử cùng với câc ion phđn mảnh vă nhờ đó mă cho phĩp xâc định câc họp phần chủ yếu trong dịch chiết. Trong nghiín cứu năy, tinh dầu câc loại cam quýt được ĩp nguội được phđn tích băng hệ thống LC Shimadzu kết nối với detector ƯV vă MS với kết nối với APCI. Quâ trình tâch bằng LC được thực hiện trín cột c 18 Pinnacle (250 X 4,6 mm, 5pL), dung dịch rửa giải đồng nhất hoặc sử dụng hỗn họp dung môi độ phđn cực tăng dần với tốc độ dịng ImL/phút: dung mơi A (THF:ACN:MeOH:H2O = 15:5:22:58) vă dung mơi B (100% ACN). Vì coumarin lă câc họp chất hấp thụ ƯV, chúng có the được xâc định tại bước sóng 315 nm. Câc điều kiện thực hiện MS u cầu như sau: cực dị điện âp cao, 4 kV; nhiệt độ APCI 400 °C, khí mang (N2) với tốc độ dòng 2,5 L/phút; điện âp dòng hoă tan cong (CDL) “25,5 V; nhiệt độ CDL 230 °C; điện âp lệch 25 V vă 60 V; vă chế độ ghi SCAN 50-500 m/z.
4.4.3. Flavonoid vă isoflavonoid
Câc flavonoid (2-phenylbenzpyron) lă nhóm lớn của câc hợp chât tự nhiín có hoạt tính sinh học, có mặt trong câc loăi thực vật bậc cao, ngoăi ra cịn được tìm thấy trong một văi loăi thực vật có hoa, bao gơm cả câc loăi tảo. Câc flavonoid tự do khâ phđn cực vă câc glycosid của chúng lă câc hợp chất rất phđn cực vă có thể được phđn lập hiệu quả bằng HPLC cột pha đảo sử dụng ODS cột c 18 với pha động lă MeOPI hoặc ACN đồng nhất hoặc với tỉ lệ tăng dần độ phđn cực. Vì những chất năy hoạt động ở vùng ƯV nín kỹ thuật HPLC-PDA được sử dụng rộng rêi để dò trực tuyến vă xâc định câc flavonoid trong dịch chiết thực vật. Câc kỹ thuật kết nối được cải tiến hơn, có thể sử dụng kết họp với câc kiểu detector MS vă NMR để tiến hănh phđn tích flavonoid. Câc flavonoid được phđn tích qua bộ phđn tích LC-PDA-MS sử dụng kết nối với ESI vă APCI được cho lă câc kỹ thuật phồ biến nhất bởi chúng cho phĩp phđn tích câc flavonoid có
khối lượng phđn tử trong phạm vi rộng như: aglycon đơn giản, glycosid có kích thước phđn tử khâc nhau vă câc hợp chất mới dạng malonate hay acetate. Tuy nhiín, câc kỹ thuật kết nối khâc như: TSP, FAB vă API cũng được sử dụng nhưng ở mức độ ít hơn. Đí xâc định chính xâc câc hợp chất flavonoid riíng lẻ có mặt trong dịch chiết thông thường kiểu thiết bị LC- MS-MS hoặc LC-NMR-MS hay được sử dụng. Ngoăi ra, trong chế độ ESI, ion giả phđn tử của câc flavonoid có trong câc dịch chiết thơ hoặc phđn đoạn hình thănh dạng [M+H?O]+, [M+Na]+ vă [M+MeOH]+ rất phổ biến trong phđn tích flavonoid. Câc flavonoid được phđn lập có thể được xâc định trực tuyến bằng câch so sânh câc dữ liệu phổ ƯV-vis vă MS với câc dữ liệu đê cơng bố hoặc câc dữ liệu có sẵn trong thư viện trực tuyến. Trong quâ trình xâc định hoạt tính chống oxi hơ từ keo ong có nguồn gốc địa lí khâc nhau, một số flavonoid được phđn lập vă xâc định định lượng bằng EC-PDA-MS (36). Dịch chiết thô chứa polyphenol gồm câc flavonoid được hoă tan trong EtOH (5 mg/mL) vă được lọc với dung cụ lọc dăi 0,45 ỊLim trước khi tiím 1 OpL văo hệ thống LC-PDA-MS. Cột Capcell Pak ACR C18 (20 X 250 mm, 5 pm) được sử dụng vă pha động lă sự kết hợp của 0.1% acid formic trong nước (dung môi A) vă 0,08% acid formic trong ACN (dung môi B). Tỉ lệ tăng dần 20-30% B trong 15 phút, 30% B từ 15- 35 phút vă 30-80% B từ 35-60 phút, với tốc độ dòng 0,2 mL/phút. Bộ phđn tích MS được thực hiện với khối phơ bẫy ion LCQ được trang bị với một giao diện ESI. Thông số hoạt động lă: điện âp nguồn 5kV, điện âp mao dẫn ES -10V vă nhiệt độ mao dẫn 260 °C. Đe xâc định mỗi peak phổ ƯV vă SIM của pho MS của tất cả câc peak được so sânh với câc peak của mẫu chuẩn cùng với cường độ ion của pho MS.
Isoflavonoid thuộc một nhóm lớn trong 700 hợp chất lă dẫn xuất của họp chất thiín nhiín, cấu trúc của câc hợp chất năy có khung cơ bản cuat 3-phenylbenzpyron (3-phenylchromon). Tương tự vói flavonoid, cấu trúc của isollavonoid chỉ khâc ở chỗ co chứa nhóm methyl, hydroxyl vă glycoside. Có 14 họp chat isoflavonoid mới được xâc định (8 họp chất isoflavonoid glycoside malonate vă 6 glycoside acetyl) trong cỏ ba lâ đỏ
(Trifolium pratensỉ) trín thiết bị LC-MS (giao diện ESI) sau đó lă 2D SPE
(37). Phô ƯV, phô khôi của câc ion phđn tử proton hoâ vă câc phđn mênh ion của chúng vă chuyển hoâ tiếp theo tạo câc glycosid đê biết dựa trín cơ
nm bởi vì hấp thụ ưv cực đại của hầu hết câc isoflavonoid nằm trong vùng giâ trị năy. Quâ trình tâch câc isoflavonoid đạt được bằng câch sử dụng cột
C18 (2,0 X 150 mm, 3 pm), rửa giải với tỉ lệ dung mơi tuyến tính từ 15%
đến 25% CAN trong dung dịch nước acid acetic (0,2% v/v) trong thời gian 36 phút vă cho đến 55% CAN trong 90 phút tiếp theo với tốc độ dòng 0,3 mL/phút. Phổ ESI-MS được ghi dưới chế độ quĩt ion dương (nhiệt độ khí 300 °C; dịng khí lăm khơ 10,0 L/phút, khí mang 40psi; diện âp mao dẫn 3,5kV, quĩt 100-800 m/z vă bộ phđn mảnh 70-100V). Câc isỏlavonoid vă dẫn xuất của chúng được xâc định bằng câch so sânh giâ trị thời gian lưu, Xmax vă câc ion [M+H]+ với câc họp chất được phđn lập vă xâc định trong câc bâo câo trước đđy.
4.4.4. Iridoid vă secoừidoid
Iridoid lă câc monoterpenoid xiclopentan-(c)-pyran, câc glycoside tạo thănh một nhóm lớn câc chất chuyển hơ bậc hai được tìm thấy trong hăng loạt câc họ thực vật. Câc secoiridoid cũng lă câc dẫn xuất glycoside cùa monoterpene nhưng có nguồn gốc từ tiền sinh tơng hợp của nó lă secologanin, ngoại trừ câc dẫn xuất thơm acyl hơ, HPLC-PDA có ứng dụng hạn chế đối với câc họp chất năy. Trong hầu hết câc phĩp phđn tích họp chất iridoid vă secoiridoid, LC-MS được sử dụng nhiều hơn. Tuy nhiín, đa số đều tốn kĩm, chảng hạn: LC-NMR, LC-MS-NMR cũng có thí được dùng đế phđn tích câc họp chất năy. Thiết bị phđn tích LC-MS kết nối với TSP, APCI vă ESI được sử dụng thường xuyín. Một số họp chất gycoside của secoiridoid được nhận biết từ loăi Gentianci rhodantha vă
Lisianthius seemannii bằng LC-MS sử dụng giao diện TSP (38,39). Thời
gian lưu vă thông tin từ phố khối được so sânh với câc mẫu chuẩn. Tuy nhiín đí xâc định ba họp chất secoiridoid nhở lă swcroside cđn phải sử dụng một bộ phđn tích LC-MS phụ với giao diện FAB.
Việc kết họp kỹ thuật CE-MS vă HPLC-MS dược thực hiện để xâc định iridoid glycoside trong loăi Picrorhiza kurroa (40). Trong kiíu CE-MS (điện âp sử dụng 25 kv vă nhiệt độ ổn định ở 30 °C) vă thiết bị sẽ dạt được điều kiện tâch chuẩn trong 16 phút, thiết bị có sử dụng mao quản silica nóng chảy vă dung dịch đệm borate (100 nM, pH 8,6) chứa 30 mM SDS vă 1% CAN. Trong thiết bị HPLC-MS, giao diện ESI được sử dụng vă câc ion chiếm ưu thế lă [M+Na]4 có thể được nhận thấy trín câc peak phơ
HPLC của iridoid glycoside. Sự tương quan giữa câc dạng iridoid được quan sât từ kết quả phđn tích LC-MS vă CE-MS.
4.4.5. Saponin
Saponin lă câc glycoside steroid hoặc glycoside triterpenoid hiện diện rộng rêi trong gan 100 họ của câc loăi thực vật. Bởi saponin lă câc họp chất có độ phđn cực cao vă khó bay hơi, nín việc âp dụng GC-MS chỉ giới hạn trong việc phđn tích câc aglycon được gọi lă sapogenin hoặc saponin. Chỉ ngoại trừ một số ít saponin khơng mang mău, câc saponin chủ yíu được phât hiện bang ƯV. Bởi vì câc saponin khơng mang mău nín câc kỹ thuật phât hiện chính lă ưv hoặc PDA khơng mang lại hiệu quả. Một kỹ thuật phât hiện thay the chủ yếu như: chỉ số khúc xạ. Đôi khi, precolumn, một dẫn suất của saponin có thể được sử dụng để gắn với một saponin mang mău tạo điều kiện để câc đầu dò uv phât hiện ở bước sóng cao hơn. Trong số câc kỹ thuật kết nối như: LC-MS, LC-NMR vả CE-MS có thể sử dụng đí săng lọc ban đầu nhanh chóng câc dịch chiít thơ hoặc câc phđn có sự hiện diện của saponin rất hiệu quả. Trong khi phđn tích băng LC-MS với giao diện TSP được sử dụng rộng rêi nhất trong phđn tích hơ thực vật, đối với câc saponin có nhiều hơn ba gốc đường khơng thể phđn tích bằng câch sử dụng kỹ thuật kết nôi năy. Đôi với câc saponin lớn hơn (MW> 800), phương phấp được lựa chọn lă CF-FAB hoặc ES.
Sự phối họp của hỗn hợp dịch chiết pha rắn được phđn tân rắn vă LC- NMR-MS đê được âp dụng để xâc định trực tuyến nhanh chóng câc asterosaponin từ sao bien Asterias rubens (25,26). Kỹ thuật LC-NMR-MS cung cấp thông tin về cấu trúc chỉ trong một phĩp sắc ký duy nhất vă rđt thích họp cho phđn tích câc saponin có khối lượng phđn tử lớn từ 1200- 1400 amu. Kỹ thuật năy cũng cho phĩp thực hiện bân định lượng bằng LC- NMR thơng qua tín hiệu methyl (Me-18 vă Me-19) của khung steroid.
4.4.6. Carotenoid
Nhóm hợp chất thiín nhiín năy bao gồm câc hydrocarbon (câc carotene) vă câc dẫn xuất oxi hoâ cùa chúng (xanthophyO/LC-TLS được âp dụng thănh công để xâc định để xâc định câc carotenoid trong bốn loăi thực vật trơi nổi trín mặt biển vă có khả năng tâch tốt câc hợp chất diadinoxanthin, diatoxanthin vă câc carotenoid khâc thu được từ dung dịch
thănh diatoxanthin vă những thay đối của câc carotenoit khâc dưới câc điíu kiện chiếu sâng khâc nhau (22). Ngoăi ra LC-TLS được cho lă một phương phâp siíu nhạy đế xâc định /?-carotene có trong câc loại thuốc bô sung từ dầu câ.
4.4.7. Ecdysteroid
Câc ecdysteroid lă câc hormon lột xâc của câc loại côn trùng vă câc động vật giâp xâc vă có trong một số ít thực vật. Hđu hít câc hợp chđt năy có khung 2/7, 3/?,14a, 20,22-pentahydroxy-5/?-cholest-7-en-6-one liín kít với nhiều nhóm hydroxy. Nhiều kỹ thuật kết nối như: LC-PDA, LC-MS, CE-MS vă LC-NMR được sử dụng rất thănh công đề xâc định trực tiếp ecdysteroid trong câc dịch chiết thô từ sản phẩm thiín nhiín.
Louden vă cộng sự đê mơ tả đặc tính vă xâc định quang phơ của ecdysteroid trong cđy thạch trúc {Lychnis floscculi) thuộc họ cđm chướng (Caryophyllaceae). Sử dụng HPLC kết nối vói nhiều đầu dị: PDA, FT-IR, NMR vă TOF MS. Kiểu TOF MS có thể xâc định cơng thức phđn tử của câc hợp chất phđn lập được qua việc đo chính xâc khối lượng phđn tử. Ba họp chat ecdysteroid: ecdysone, 20-hydroxyecdysne vả makisteron A có nồng dộ 10-20 mg/mL trong D2O được sử dụng như câc họp chất chuẩn.