3.2.5. Câc ứng dụng của sắc ký lớp mỏng
Kỹ thuật SKLM hiện nay được sử dụng rộng rêi đối với ngănh hóa hữu cơ, đặc biệt lă với hóa học câc hợp chất thiín nhiín. Câc ứng dụng chủ yếu cùa sắc ký lớp mỏng bao gồm:
- Xâc định được độ tinh khiết vă một số đặc trưng của hợp chất thông qua giâ trị Rf trong hệ dung môi xâc định.
- Xâc định thông tin sơ bộ của mẫu chiết như số hợp chất, độ phđn cực cúa câc họp chất trong mẫu để từ đó định hướng câc nghiín cứu tiếp theo như lựa chọn hệ dung môi phù họp cho sắc ký cột.
- Có thế theo dõi q trình sắc ký cột để có thơng tin về câc phđn đoạn tâch hoặc theo dõi tiến trình của phản ứng tơng họp hóa học.
3.3. Sắc ký cột
Sắc ký cột lă một phương phâp chi phí rất thấp được sử dụng để tâch câc hợp chất hóa học từ hỗn hợp câc họp chất. Phương phâp năy rất hữu ích cho việc tâch vă tinh chế chất rắn vă chất lỏng. Pha tĩnh trong sac ký cột được nhồi trong ống hình trụ bằng thĩp hoặc thủy tinh. Tùy theo tính chất cua pha tĩnh mă ta chia ra thănh sắc ký theo cơ chế hấp phụ (cột hấp
phụ), cơ chế phđn bố (cột phđn bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đối ion).
Hình 3.7. Bộ sắc ký cột [BioMedia Việt Nam]
3.3.1. Nguyín tắc
Trong sắc ký cột, pha động lă dung môi được cho chảy qua pha tĩnh được nhồi trong cột. Cột lă những ống lăm bằng thủy tinh hoặc bằng thĩp, đầu dưới có khóa, đầu trín có nút măi để nối với một phễu chứa dung môi, loại năy thường được bân sẵn trín thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ. Hoặc cột cũng có thí tự Ịấp bằng một ống thủy tinh thường, đầu dưới nhỏ vă được điều chỉnh tốc độ chảy bang khóa. Pha tĩnh nhồi trong sắc ký cột thường dùng lă Oxide nhơm, silica gel, than hoạt tính, polyamide,...
Oxide nhỏm trung tính (Merck), cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-200 mesh). Trong nghiín cứu tâch câc hợp chất thiín nhiín, silica gel lă pha tĩnh được dùng rộng rêi nhất. Dung môi dùng trong sắc ký cột có thí lă từng loại riíng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung mơi với tỉ lệ thích họp.
Độ hoạt hóa số:
I II III IV V
Ơ.5 % H2O 2,4 % H2O 4,3% H2O 6,6% H2O 15% H2O
I II III IV V
1,2 % H2O 3.5 % H2O 5.8% H2O 8.1% H2O 10% H2O
- Silica gel -60 cỡ hat 0,063-0,200 mm. - Polyamide M-K cỡ hạt < 0,07 mm
Kích thước cột ảnh hường rất lớn đến hiệu quả tâch của quâ trình sắc ký cột. Thơng thường cột có đường kính cột nhỏ vă chiều dăi cột căng dăi thì sự tâch căng tốt. Đng kính lOmm 20 mm 30 mm 40 mm 50 mm Rf > 0.2 100 mg 0.5 g 1 g 1.5 g 2.5 g RrO.l 40 mg 150 mg 350 ĩĩig 0.5 g 1 g
Hình 3.8. Lựa chọn đường kính cột sơ bộ [BioMedia Việt Nam] 3.3.2. Kỹ thuật triển khai
3.3.2.1. Chuẩn bị cột
Rửa sạch cột, trâng với dung môi như acetone hoặc nước cất, sau đó để khơ.
Nhồi một ít bơng hoặc vải thủy tinh văo đây cột nếu đây cột khơng có một lớp lọc frit (hoặc thím một lớp cât mịn sạch văo giữa lóp lọc frit vă silica gel).
Cột được kẹp thẳng đứng trín giâ (chú ý sử dụng loại kẹp có bọc cao su đe trânh lăm vỡ cột).
Pha tĩnh trong cột sâc ký cần được phđn tân đồng đều vă tạo thănh khối đồng nhất ở trong cột.
Quâ trình cho chất hấp phụ văo cột được gọi lă nhồi cột. Trọng lượng chất phđn tích
Tỷ lệ = -------------------- -—----------- Trọng lượng chất hấp phụ
Dựa văo việc phđn tích kết quả trín TLC mă ta chọn tỷ lệ chất phđn tích trín tỷ lệ chất hấp phụ cho phù hợp, thơng thường tỷ lệ năy tìr 1/20,
1/50, 1/100...
Bảng 3.4. Hướng dẫn tỷ lệ silica/mẫu phụ thuộc văo khả năng tâch trín
bản mong [BioMediaViet nam]
Phđn tâch
dễ •
•
Tỷ lệ silica gel (g) /mẫu (g): 20:1
Phđn tâch
trung bình •
•
Phđn tâch
khó Tỷ lệ silica gel (g) /mẫu (g): 100:1
- Có 2 câch nhồi cột: nhồi cột ướt vă nhồi cột khô.
Nhồi cột ướt: Đối với câc chất hấp phụ có khả năng trương phình như
silica gel, Sephadex đế trânh việc bị nứt cột thì phải ngđm trong dung môi trước một thời gian trước khi cho văo cột. Cđn vừa đủ lượng chất hấp phụ, sau đó trộn đều với dung môi thănh một hỗn họp dịch vă rót văo cột, chất hấp phụ sẽ lắng xuống đây cột lăm cho cột trở nín đồng nhất. Đe trânh cột bị bọt khí, hỗn dịch dung mơi vă chất hấp phụ cần vừa phải, không quâ sệt cũng không quâ lỏng đe phải rót nhiều lần. Đe cột ổn định, trong quâ trình nhồi cột cần phải để cho dung mơi chảy liín tục. Cột nhồi xong vẫn đe dung mơi chảy thím một khoảng thịi gian nữa để hoăn toăn ổn định. Người ta thường cho lóp cât hoặc bơng văo bề mặt trín của cột đí trânh lăm xâo trộn gel khi ta cho thím dung mơi văo.
Nhồi cột khô: Đối với câc chất hấp phụ khơng có khả năng trương nở
như AI2O3, CaCƠ3 ta sử dụng phương phâp nhồi cột khô. Cột được dựng thăng đứng, cho lớp bơng văo phía dưới đây cột đí giữ chất hấp phụ. Cđn khối lượng chất hấp phụ vừa đủ rồi cho tự từ văo cột đồng thời dùng bóng cao su gõ đều xung quanh cột từ dưới lín trín de cho chat hấp phụ on định. Khi chat hấp phụ được cho hết văo cột, rót dung mơi văo vă cho chảy liín tục một thời gian để cột được ổn định vă không được đe khơ dung mơi trong cột.
Hình 3.10. Nhồi cột khơ (BioMedia Việt Nam)
3.3.2.2. Đưa chất phđn tích văo cột
Chất phđn tích trước khi cho văo cột được phđn tân đều thănh một lóp mỏng đồng đều trín mặt thơng phăng. Câc phương phâp đe đưa chất phđn tích văo cột thường được sử dụng lă:
Sừ dụng đĩa giấy: Giấy lọc có bề mặt dăy được cât thănh hình trịn nhỏ
có đường kính bĩ hơn đường kính cột khoảng 0,5 mm vă được chđm câc lỗ thủng nhỏ câch đều nhau. Câc tđm giấy lọc nhỏ năy được ngđm trong dung dịch đậm đặc của mẫu cần tâch chất, sau đó lấy giấy ra vă sấy nhẹ đế loại bỏ hết dung mơi. Tùy văo lượng chất, kích thước cột mă có thể sử dụng nhiều lóp giấy lọc.
đĩa giấy. Cho một lớp cât mịn lín trín đĩa giấy vă bắt đầu cho dung mơi chảy.
Cho dung dịch mẫu lín cột: Mầu được hòa tan hoăn toăn bằng lượng
dung môi vừa dử? Sử dụng pipet hút dung dịch cho chảy từ từ dọc theo thănh cột. Cho dung dịch mẫu ngấm từ từ văo cột bằng câch mở khóa cho dung môi chảy ra từ từ. Khi mẫu được đưa hết văo cột. dùng dung môi để rửa thănh cột vă cho dung môi phù hợp văo để tiến hănh sắc ký. Trong quâ trình cho mẫu văo cột chú ý khơng được để cột bị khơ ở lóp chất hđp phụ đầu cột. Phương phâp năy được sử dụng nhiều vì có nhiều ưu điềm đó lă dễ dăng, nhanh gọn. Tuy nhiín can chú ý mẫu phải tan hoăn toăn trong dung môi chạy sắc ký, trong q trình cho mẫu lín vă sắc ký khơng được lăm xâo trộn bề mặt trín của cột. Mau được ngấm từ từ hết văo cột rôi mới cho dung mơi văo để tiến hănh q trình sâc ký.
Trộn mẫu với một lượng chất hấp phụ: cho chất hấp phụ trộn đều với
mẫu đê được hòa tan hoăn toăn trong dung mỏi. Dung mơi được loại bó băng câch sử dụng cô quay chđn không hoặc sấy khơ. Sau đó nghiền nhỏ thănh bột vă cho văo cột trải đều thănh 1 lớp trín bề mặt cột. Tiếp theo, cho dung môi văo vă tiến hănh sắc ký.
3.3.2.3. Rửa cột
Quâ trình giải ly câc hợp chất ra khỏi cột được gọi lă q trình rửa cột. Ta có thể tiến hănh rửa cột ở âp suất thường hoặc âp suất nĩn tùy thuộc văo bản chất, đường kính chất hấp phụ hoặc tốc độ của pha động. Neu chất hấp phụ có kích thước lớn. mẫu nhiều chất có độ phđn cực khâc nhau tốc độ chảy chậm nhò’ văo trọng lực. Khi cần điều chỉnh tốc độ chảy theo ý muốn ta sử dụng rửa cột bằng âp suất nĩn. Cột sử dụng âp suđt nĩn cđn có nút kín được giữ chặt ở đầu cột. Thường kích thước chất hấp phụ ở cột sử dụng âp suất nĩn lă khâ nhỏ.
Tùy thuộc văo độ phđn cực của dung mơi rửa giải mă câc hợp chđt có thí bị hấp phụ mạnh hay yếu ở trong cột. Dung môi rửa giải thường được tinh chế lại để đảm bảo độ tinh khiết bởi câc tạp chất có thí lăm thay đơi độ phđn cực do đó ảnh hưởng đín kít quả tâch.
Dung mơi sắc ký phải thay đối một câch từ từ đế đảm bảo an toăn cho cột. Bởi vì một số chất hấp phụ như AI2O3 hoặc silica gel khi được trộn
với dung môi bất kỳ sẽ sinh ra nhiệt lăm cho dung mơi hóa hơi cục bộ tạo ra bọt khí lăm nứt gêy cột, ảnh hưởng đến hiệu quả tâch.
Tốc độ dòng chảy của pha động cũng cần phải điều chỉnh hợp lý, nếu chậm quâ hoặc dừng sẽ lăm cho chất phđn tâch bị khuếch tân, hiệu quả tâch bị ảnh hưởng; nếu nhanh quâ thì sẽ khơng đạt được cđn bằng được với chất hấp phụ.
Bảng sắp xếp dưới đđy của Trappe theo thứ tự tăng dần lực phản hấp phụ của một sô dung môi:
Ether dầu hỏa - cyclohexane - tetrachloro carbon - trichloroethylene - toluene - benzene - methyl chloride - chloroform - diethyl ether ethylacetate - pyridine- acetone - /7-propanol - ethanol - methanol - nước
Trong nghiín cứu, để tăng hiệu quả tâch người ta thường sử dụng hỗn hợp câc dung môi với câc tỷ lệ phù hợp với mẫu nghiín cứu.
Bâng 3.5. Một số hỗn họp dung môi thường dùng cho câc họp chất phđn
cực (dùng cho sâc ký cột vă sắc ký lóp mỏng)
- ■ —- ■■ ................r ■ ■ 7 2 "2
Hệ dung môi dùng cho chđt hđp phụ cơ điín
1 CHCh/MeOH /H2O
2 BuOH/AcOH/H2O
3 CHCh/MeOH/EtOAc/ H2O
4 BuOH/ EtOAc/ H2O
5 EtOAc/Acetone/MeOH/EhO 6 Benz/Dioxane/AcOH 7 Benz/MeOH/AcOH 8 EtOAc/ Acetone/MeOH/HEO 9 EtOAc/AcOl I/II2O 10 Benz/Acetone/AcOH
Hệ dung môi dùng cho chất hấp phụ pha đảo
11 MeOH/I-hO
12 CH3CN/H2O
13 CH3CN/MeOH/H2O
Theo dõi quâ trình giai ly cột:
Quâ trình phđn tâch câc chất khi ra khỏi cột được theo dõi bằng sắc ký bản mỏng. Người chạy cột có thể chạy sắc ký bản mong lần lượt từng ống hứng vă có so sânh-với mẫu cần phđn tích (mẫu thường được chạy trín cùng một bản vă chấm ở giữa bản mỏng). Ngoăi ra, nếu chất cần tâch có mău thì có thể theo dõi bằng mắt thường nhưng đề chính xâc vẫn phải kiểm tra bang sắc ký bản mỏng.
3.3.3. Sắc kỷ cột nhanh (Flash chromatography)
Săc ký cột nhanh ra đời nhằm rút ngắn thời gian chạy sắc ký cột để hạn chí việc phđn hủy câc chất cần tâch trong quâ trình chạy sắc ký cột, cũng như tiít kiệm dung mơi chạy cột. Phương phâp năy do Still vă cộng sự công bố văo năm 1978 vă được cấp bằng phât minh văo năm 1981 (ƯS Patent 4293422). Theo Still thì sắc ký cột nhanh hạn chế được hai nhược điím của sắc ký cột thơng thường lă giảm thiểu sự phđn hủy câc chất vă hiện tượng tạo vệt (tailing) khi tâch câc hợp chất thiín nhiín.
về ngun tắc thì sắc ký cột nhanh cũng giống sắc ký cột thơng thường chỉ khâc ở việc có sử dụng âp suất đe đđy nhanh pha động ra khỏi cột.
Cột thủy tinh:
Cột dùng trong sắc ký cột nhanh thường lă cột sắc ký ngắn, được lăm băng thủy tinh. Phía trín cột có nhâm hoặc hệ thống kết nối với bộ phận dẫn khí nĩn (có thể dùng khơng khí hoặc khí N2). Âp lực khí trong cột dược điều chỉnh bởi van điều âp.
Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thể tích dung mơi rửa cột vă câc phđn doạn được ghi trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Sự tương quan giữa đường kính cột, lượng mẫu, thế tích
' dung mơi Đường kính cột (mm) Thể tích dung môi rửa (inL)
Lượng mẫu cho văo
(mg) Phđn đoạn (mL) ARf >0,2 ARf>0,l 10 100 100 40 5 20 200 400 160 10 30 400 900 360 20 40 600 1600 600 30 50 1000 2500 1000 50
Chất nhồi cột:
Trong FC, chất hấp phụ chủ yếu lă silica gel với câc cỡ hạt nhỏ 230- 400 mesh.
Bảng 3.7. Câc loại silica gel dùng trong FC
Nhên hiệu Loại silica
gel
Cõ’ hat • (mm)
Diện tích bề • mặt (cm2/g)
Am icon (Danvers, MA) Si 60
Si 100 20-30 50-105 500(60 Ậ) 300(100 Ấ) J.T.Baker (Phillipsburg, NJ) Si 60 40-63 63-200 100-425 480 EM.Science / Merck Gibbstonin, NJ Si 40 Si 60 Si 100 25-40 63-200 40-63 63-100 15-40 675 (40 Ạ) 550 (60 Ấ) 420 (100 Ắ)) 1CN (Woelm) (Cleveland, OH) Si 60 10-18 10-35 18-32 32-63 32-100 63-100 63-200 500-600 Universal absorbents (Atlanta, GA) Si 60 18-32 32-63 63-100 53-200 100-200 500-600 Whatman (Clifton NJ) Si 40 13-24 37-53 75-40
Dung môi rứa cột:
dung mơi thích hợp, sao cho chất phđn cực nhất trong hồn hợp có giâ trị R|'> 0,35.
Ngoăi ra, sự khâc biệt về hằng số Rf của câc chất trong mẫu lă ARr
>0.15. Tuy nhiín, trơng một số trường hợp nếu ARfkhơng đạt u cầu trín thì có thể dùng giải phâp tăng chiều dăi cột vă giảm lượng mẫu phđn tích vă điều chỉnh hệ dung mơi.
Bảng 3.8. Âp dụng FC để tâch câc hợp chất thiín nhiín
Họp chất Nguồn thực vật Chất hấp phụ
Dung môi rửa
Neolignan Piperfuto kasnra
Piperaceae SÌO2 Hexane- EtOAc Sesquiterpene Candle vdnterane Canellaceae
SiO2 Diethyl ether - Hexane
Capsaicinoid Onion RP-18 MeOFI
Alkaloid quinolizidine Lipinus argentens Fabaceae AI2O3 (Merck) Diethyl ether Ethyl methyl ether Nhồi cột:
Cột cho FC cũng được nhồi như sắc ký cột thông thường vă thường nhồi theo phương phâp nhồi cột khô. Sau khi dung môi chạy cột được đô đầy văo cột thì mở van đe tạo âp suất trong cột. Mở khóa dí dung mơi được đuối ra khởi cột. Tiếp theo, cho mẫu văo cột sao cho tất cả mẫu thđm
đều văo lớp silica gel. Sau đó, dùng pipet rửa thănh cột. Cho dung môi đầy văo cột, lắp hệ thong tạo âp suất trong cột, mở khóa vă hứng mầu. Trong q trình nhồi, cho mẫu văo cột vă chạy cột không đe cột bị khô.
3.3.4. Sắc kỷ nhanh - cột khô (Dry-column flash chromatography)
Sắc ký nhanh - cột khô dùng phễu lọc xốp bằng thủy tinh được gan trín
bình tam giâc. Bình năy nối văo hệ thống tạo âp suất thấp (thường lă dùng vịi nước hoặc mây bơm chđn khơng).
Chất hấp phụ thường dùng lă silica gel dùng cho SKLM tức loại có độ mịn hạt 40-15 mm hoặc AI2O3 dùng cho SKLM.
Cho từ từ chất hấp phụ văo phễu lọc ở trạng thâi khơ, lắp phễu lín trín bình tam giâc, gõ nhẹ văo thănh phễu để chất hấp phụ được nĩn đều, tạo thănh một khối đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt phang. Chiều cao của chất hấp phụ thường lă 5 cm.
Hịa tan mẫu văo một dung mơi kĩm phđn cực, nạp văo cột, bật hệ thống tạo âp suất thấp, dung dịch mẫu sẽ được tham văo phần silica gel ở đầu cột thănh một lóp mỏng đều.
Cũng có thể nạp mẫu ở dạng khơ như khi chạy sắc ký cột thường. Sau đó, cho một lượng dung mơi vừa đủ lín bề mặt phễu, bật âp suất thấp đí hút hết dung mơi xuống bình tam giâc. Tắt hệ thống âp suất thấp, giót dung