Khi so sânh với kỹ thuật chiết Soxhlet, phương phâp PLE lăm giảm thời gian chiết đâng kế cũng như lượng dung mơi sử dụng. Ngăy nay, đí chiít câc hợp chất phđn cực, PLE lă một phương phâp tiềm năng có thí thay thí cho phương phâp SFE. PLE cịn có tâc dụng trong tâch câc tạp chất hữu cơ bền với nhiệt ra. PLE đê được ghi nhận có thể tâch được câc hoạt chất từ bọt biển. Ta có thế dễ dăng tìm thấy câc tăi liệu hướng dẫn úng dụng kỹ
thuật năy trong phđn tâch hợp chất thiín nhiín trong câc tư liệu khâc nhau. Thím văo đó, do chỉ sử dụng một lượng ít dung mơi, nín đđy cũng lă một phương phâp thđn thiện với môi trường.
PLE đê được ứng dụng thănh công văo việc tâch chiết câc hoạt chất khâc nhau từ nguyín liệu thực vật. Sử dụng câc điều kiện tối ưu, câc isoflavone đê được tâch ra từ đậu nănh (đông lạnh) mă không bị phđn hủy. Người ta đê so sânh kỹ thuật ASE dùng đề chiết câc terpenoid vă steroid từ thuốc lă với kỹ thuật Soxhlet vă siíu đm. Dựa văo câc yếu tố như sản phẩm, khả năng tâi sử dụng, thời gian chiết, dung mơi tiíu tốn, phương phâp ASE có thế thay thế cho phương phâp truyền thống nhờ thời gian chiết ngắn vă tốn ít dung mơi hon. Khi sử dụng PLE chiết câc flavonoid từ rau Bina dùng hệ dung môi ethanol-nước (70:30) ở 50 - 150 °C cho hiệu suất tốt hon lă dùng nước ở 50 - 130 °C. Câc yếu tố như: 'nhiệt độ, âp suất, kích thước, lượng dung môi, tý lệ mẫmdung môi đều ảnh hưởng đến hiệu suất tâch câc phenolic từ rau mùi tđy (Petroselimum crispurn). Kỹ thuật năy cũng được tối ưu đe âp dụng tâch lycorine vă galanthamine (Amaryllidaceae alkaloid) từ Narcissus jonquilla vă nó cho kết quả tốt hon câc phương phâp còn lại. Câc hợp chat phenolic như gallocatechin (GCT), catechin, epicatechin gallate, acid caffeic, myricetin vă phenol tơng đíu được chiết từ câc bộ phận khâc nhau của cđy Anatolia proPolys sử dụng PLE ở điều kiện tối ưu (40 °C, 1500 psi trong 15 phút).
2.7. Câc yếu to ảnh huỏng đến quâ trình chiết xuất
Khi chiết tâch câc hợp chất thiín nhiín trong sinh vật, người ta thường trích ly ln câc tạp chất hay có trong sinh vật như chất bĩo, chất mău. Những tạp chất năy sẽ lăm cản trở q trình phđn lập tinh chí câc hoạt chđt muon khảo sât.
Chat hĩo (lỉpỉd)
- Thường được loại bang những dung môi không phđn cực, nhưng chúng cũng có the chiết xuất bởi những dung mơi phđn cực.
- Câc loại họp chất năy có thể được nhận thấy khi sắc ký lóp mong vă hiện mău bởi hơi iod sẽ cho những vệt mău nđu.
4- Bột nguyín liệu trước tiín phải được ly trích bằng ether dầu hỏa
cho thật kiệt, sau đó phơi khơ bột cđy rồi trích tiếp bằng câc dung mơi khâc.
+ Dùng .sắc ký cột nhanh (flash-chromatography): dung môi giải ly lă ether dầu hỏa hoặc hexane.
Với chất mău (pigment): rất khó loại, ở nhiệt độ phịng thí nghịím có
thể dùng than hoạt tính, acetate chì, hoặc để trong tủ lạnh cho tủa.
Câc hợp chất polyphenoỉ-tanin: thực vật thường chứa tanin với hăm lượng cao. Muốn loại bở tanin ra khỏi dịch chiết nước, người ta thường cho dung dịch ly trích qua cột hấp phụ có chứa polyamide, Sephadex LH- 20....
Câc chất dẻo (plasticizero):
- Câc chất dẻo như phtalat dialkyl, acetyl tri-77-butyl citrate, tributyl phosphate,... thường lă tạp chất lẫn trong dung môi, hoặc lă câc phụ gia của thùng chứa lăm bằng chất dẻo.
- Trong chloroform vă methanol thường có chứa phtalat di-2-ethyl hexyl, trước đđy đê bị lầm tưởng lă họp chất thiín nhiín cơ lập từ cđy cỏ.
Ngoăi ra khi chiết tâch, cần phải chú ý đến câc chất bôi trơn như silicon chđn không ở thiết bị cô quay chđn không, câc chat artefact lă những chất chỉ hình thănh trong quâ trình chiết xuất, thường lă những dẫn xuất của câc hợp chất thiín nhiín. Muốn hạn chế những trường họp năy cần phải sử dụng câc điều kiện chiết xuất, cơ lập ím dịu.
Tại mỗi giai đoạn của quâ trình chiết xuất, đều có thế tạo nín những họp chat artefact năy.
Ví dụ: Trong khi loại dung môi cuả dung dịch chiết xuđt đí thu cao, sự có mặt câc muối ion vơ cơ, những vet acid có thế lă tâc nhđn cho một sô phản ứng.
Một văi dung mơi như acetone, methanol vă ethylen glycol có thí tạo nín câc dẫn xuđt.
Chất hấp thụ dùng trong sắc ký cột như alumin có thể gđy nín phản ứng ngưng tụ, phản ứng chuyển, phản ứng cộng nước hoặc phản ứng khử nước, silica gel cũng có thế gđy nín phản ứng oxy hóa.
Tăi liíu tham khảo
1. Vladimir Kislik (2012), Solvent Extraction 1st Edition: Classical
and novel approaches. Elsevier.
2. Jan Rydberg (2004), Solvent Extraction Principles and Practice, Revised and Expanded, CRC Press.
3. Mohammed Wasim Siddiqui, Vasudha Bansal, Kamlesh Prasad
(2016), Plant Secondary Metabolites, Volume Two: Stimulation,
Extraction, and Utilization, CRC Press.
4. H.-F. Zhang, X.-H. Yang, Y. Wang (2011), Microwave assisted extraction of secondary metabolites from plants: current status and future directions, Trends FoodSci. Tech., 22, 672-688. 5. L. Paniwnyk, H. Cai, s. Albu, T.J. Mason, R. Cole (2009), The
enhancement and scale up ofthe extraction of antioxidants from
Rosmarinus officinalis using ultrasound, Ultrason. Sonochem.
16, 287-292.
6. Mamata Mukhopadhyay (2000), Natural Extracts Using
Supercritical Carbon Dioxide, CRC Press.
7. C.H. Chang, R. Yusoff, G.c. Ngoh, F.w. Kung (2011), Micro wave assisted extractions of active ingredients from plants, J. Chromatogr. A 1218 6213-6225.
8. X. Tong, X. Xiao, G. Li (2011), On-line coupling of dynamic microwave-assisted extraction-high speed counter-current chromatography for continuous isolation of nevadensin from
Lyeicnotus pauciflorus Maxim, J. Chromatogr. B 879 2397-
2402.
9. s. Gao, w. Yu, X. Yang, z. Liu, Y. Jia, H. Zhang (2012), On-line ionic liquidbased dynamic microwave-assisted extraction-high performance liquid chromatography for the determination of lipophilic constituents in root of Salvia miltiorrhiza Bunge, J.
Sep. Sei. 35 2813-2821.
11. M. Herrero. J.A. Mendiola. A. Cifuentes. E. Ibanez (2010), Supercritical fluid extraction: recent advances and application, J.
Chromatogr. A 1217 2495-2511.
12. T. Fornari, G. Vicente, E. Vazquez, M.R. Garcia-Risco, G. Reglero (2012). Isolation of essential oil from different plants and herbs by supercritical fluid extraction, <7. Chromatogr. A 1250 34- 48.
13. M.c. Henry. C.R. Yonker (2006), Supercritical fluid chromatography, pressurized liquid extraction, and supercritical fluid extraction. Anal. Chem. 78 3909-3916.
14. A. Mustafa, c. Turner (2011), Pressurized liquid extraction as a green approach in food and herbal plants extraction: A review,
Anal. Chim. Acta 703 8-18.
15. Yi Yang vă Fan Zhang (2008), Ultrasound-assisted extraction of rutin and quercetin from Euonymus alatus (Thunb.) Sieb,
Ultrason Sonochem. 15(4):308-31.
16. Hui Li, Bo Chen, vă Shouzhuo Yao (2005), Application of ultrasonic technique for extracting chlorogenic acid from Eucommia ulmodies Oliv. (E. ulmodies), Ultrason
Chuong 3
Câc kỹ thuật phđn lập câc hợp chất thiín nhiín có hoạt tính sinh học
3.1. Giói thiệu chung
Bản chất của câc hợp chất có trong dịch chiết thơ hoặc câc phđn đoạn phải được xem xĩt trước khi thiết lập, lựa chọn câc phương phâp phđn lập. Câc đặc diím chung đâng chú ý của câc phđn tử có trong dịch chiít thơ nham xâc định câc phương phâp phđn lập chúng bao gồm độ tan (ưa nước hoặc kị nước), tính acid-base, điện tích, độ bền vă kích thước phđn tử. Để xâc định cấu trúc hóa học,-câc nhă khoa học phải tìm câch phđn lập riíng rẽ câc hợp chất, từ đó kỹ thuật phđn lập câc họp chất ra đời với tín gọi sắc ký (chromatography).
Phương phâp sắc ký đê vă đang được ứng dụng rộng rêi đế phđn lập câc hợp chất nhưng do câc họp chất thiín nhiín khâ đa dạng với trọng lượng phđn tử lớn nhỏ khâc nhau, tính phđn cực nhiều hay ít khâc nhau cho nín khơng có một kỹ thuật sắc ký chung,...
Níu phđn lập một hợp chất đê biết từ cùng một sinh vật hoặc từ một sinh vật mới, thật dễ dăng đế có được tăi liệu về điều kiện sắc ký của hợp chất năy, do đó có thế lựa chọn phương phâp phđn lập thích hợp nhất mă khơng gặp bất kỳ khó khăn năo. Tuy nhiín, một dịch chiết thô chưa biết rõ thănh phần câc loại hợp chất sẽ rất khó khăn để xâc định, lựa chọn phương phâp phđn lập phù họp. Trong trường hợp năy, nín tiến hănh câc thử nghiệm định tính đối với sự hiện diện của câc loại họp chất khâc nhau, ví dụ phenol, steroid, alkaloid, flavonoid... bang phương phâp sac ký lớp mỏng phđn tích (TLC) hoặc phương phâp sac ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ví dụ. đế xâc định câc hợp chất phđn cực từ dịch chiết methanol hoặc phần phđn đoạn từ dịch chiết ta sử dụng phương phâp HPLC pha đảo (RP-HPLC).
3.1.1. Khâi niệm về phưong phâp sắc ký
Phương phâp sắc ký được sử dụng đí tâch câc hợp chất ra khỏi một
hỗn hợp câc chất. Nguyín tắc phđn tâch của sắc ký được dựa trín sự hấp phụ khâc nhau của câc 'chất văo hai pha luôn tiếp xúc vă không hoă lẫn văo
nhau đó lă pha tình vă pha động. Khi câc thănh phần trong mẫu nạp văo cột tâch hấp phụ văo pha tĩnh, pha tĩnh trì hoên sự di chuyển của câc hợp chđt lăm cho câc chất năy di chuyến qua cột sắc ký với tốc độ khâc nhau vă câc hợp chđt năy sẽ được tâch khởi nhau theo thời gian. Khoảng thời
gian mă mồi hợp chat đi qua cột được gọi lă thòi gian lưu. Đối với phương
phâp sac ký, hồn hợp câc chất được mang bởi chất lỏng hoặc khí vă câc thănh phần được tâch ra dựa văo sự phđn bố khâc nhau của câc chất trong
pha tĩnh vă pha động.
Đôi với việc phđn tích câc hợp chất phức tạp câc nhă khoa học đê sử dụng câc kỹ thuật khâc dựa trín âi lực khâc nhau của câc chất trong pha động lă chất khí hoặc chất lóng vă đối với pha tĩnh mă chúng di chuyển qua như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate,...
Ưu diím của phương phâp sắc ký lă triển khai nhanh, dễ dăng, không
ânh hưởng nhiều đến cấu trúc câc hợp chất do đó được sử dụng khâ nhiều trong nghiín cửu định lượng protein hay câc phđn tử.
3.1.2. Cức hước của quâ trình sắc ký
Đẻ triền khai q trình sắc ký cần có 3 giai đoạn chính:
a) Nạp hỗn hợp mẫu lín pha tĩnh: Câc hợp chất được giữ trín pha tĩnh. b) Tiín hănh sắc ký bằng câch cho pha động đi qua pha tĩnh: pha động sẽ kĩo câc hợp chất di chuyển trín pha tĩnh với tốc độ khâc nhau, tâch khỏi nhau vă có vị trí khâc nhau trín pha tĩnh tạo thănh sắc ký đồ
(chromatogram). Giai đoạn năy gọi lă triền khai sắc ký.
+ Câc hợp chất lần lượt được rửa giải ra khởi pha tĩnh khi tiếp tục pha
động chạy qua. Đđy được gọi lă q trình rửa giải, dung mơi sử dụng gọi lă dung môi rửa giải vă dịch hứng được ở cuối cột gọi lă dịch rửa giải
(eluate).
+ Câc hợp chất cũng có thể tâch ra bằng câch lấy một phần pha tĩnh
chứa chất hấp phụ đem chiết lấy chất.
c) Phât hiện câc chất: để phât hiện câc hợp chất, ngoăi câc chất mău có thế phât hiện dễ dăng, chúng ta sử dụng đỉn tử ngoại hay câc thuốc thử đe xâc định câc hợp chất không mău. Bộ phận đặt sau cột giúp phât hiện câc chất khi chúng đi ra khỏi cột được gọi lă dete.ctor đặt sau cột.
3.L3. Phăn loại câc phương phâp sắc kỷ
3. ỉ .3.1. Dựa văo ban chai vật lý cùa pha động vă pha tĩnh
Dựa văo bản chất vật lý của câc pha (pha động có thể lă chất lỏng hoặc chất khí, pha tĩnh có thể lả chất rắn hoặc chất lỏng) ta phđn chia ra thănh câc phương phâp như sau:
Sac ký lỏng:
4- Sắc ký lóng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) 4- Sắc ký lỏng - rắn (liquid - solid chromatography LSC)
Sac ký khí:
4- Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC)
+ Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC)
3.1.3.2. Dựa văo câc hiện tượng của sắc kỷ
4- Phương phâp sâc ký lỏng - rắn vă khí - rắn: lă phương phâp trong đó
pha tĩnh lă chất rắn có khả năng hấp phụ. Đđy được gọi lă sắc ký hấp phụ.
4- Bản chất của sắc ký phđn bố (partition chromatography) lă phương
phâp trong đó pha tĩnh được cấu thănh từ chất lỏng không hoă lẫn được với pha động, chất long năy được phủ trín bề mặt của chất rắn được gọi lă chất mang hay giâ mang vă phải lă chất trơ, không tham gia văo sắc ký. Sắc ký phđn bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng vă sắc ký khí - lỏng.
4- Đối với sắc ký trao đối ion pha tĩnh được tạo thănh từ chất nhựa trao
dối ion chứa chất cao phđn tử mang những ion có khả năng trao đối với câc ion cùng dấu của hỗn hợp dung dịch sắc ký.
4- Sắc ký theo kích cỡ (size - exclusion chromatography): cịn gọi lă
sắc ký trín gel. Câc phđn tử sẽ được tâch ra khỏi nhau theo kích thước. Phđn tử lớn ra trước, phđn tử có kích thước nhỏ ra sau do nó di chuyển chậm hơn.
3. ỉ .3.3. Dựa văo kỹ thuật vă phương tiện sắc kỷ Theo phương phâp giữ pha tĩnh:
+ Neu sử dụng cột băng kim loại hay thủy tinh đe chứa pha tĩnh thì ta gọi đđy lă săc ký trín'cột (column chromatography: CC)
+ Khi pha tĩnh lă silica geL nhôm oxide, xenlulose, chất nhựa trao đổi lớn được trâng đều vă giữ trín bề mặt phăng của thuỷ tinh, nhựa hay nhôm với bề dăy khoảng 0.25-0.5mm ta gọi lă sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC).
+ Neu pha tĩnh lă chất lỏng được thấm trín một loại giấy đặc biệt ta gọi lă sắc ký giấy (paper chromatography - PC).
Theo câch tri en khai pha động ta có:
+ Cho pha động kĩo câc hợp chất tâch ra trín pha tĩnh ta gọi lă sâc ký khai triển (development chromatography).
+ Nếu câc chất lần lượt được tâch ra ngoăi pha tĩnh bằng câch cho pha động chạy qua pha tĩnh thì ta gọi lă sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy).
3.2. Sắc ký lóp mỏng
3.2. Ị. Nguyín tắc
Bản chất của sâc ký lớp mỏng lă pha động được cấu thănh từ chất lỏng được cho đi qua một chất hấp phụ tro’ như silica gel hoặc nhôm oxide được trâng mỏng, đều, phủ lín nen phang như thủy tinh, nhơm, plastic... Do đó phương phâp năy được gọi lă sắc ký lóp mỏng (SKLM).
Đe thực hiện sâc ký, trước tiín người ta cho mẫu phđn tích hịa tan văo trong một dung mơi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm 1 vết nhỏ gọn lín lớp mong sau đó dung mơi đưọ‘c đi đi đế lại mẫu ở dạng bột khơ bâm trín lớp mỏng. Lóp mỏng được đặt theo chiíu thắng đứng văo trong một bình triển khai sắc ký có dung mơi thích hợp, dung mơi sẽ bị lực mao quản hút lín phía trín, câc chất có trong mẫu sẽ được phđn chia thănh những vết riíng biệt. Câc chất được phât hiện nhờ sử dụng câc phương phâp vật lý như nhìn băng mắt. soi dưới đỉn tử ngoại hoặc bằng phương phâp hóa học (phun lín bảng mỏng câc loại dung mơi hay thuốc thử).
Một chất được cho lă tinh khiết khi trín lóp mỏng nó chỉ hiện một vết trịn, có giâ trị Rf khơng đổi trong một hệ dung mơi xâc định. Giâ trị Rf được tính như sau:
Vạch trín dung mịi
Vạch xuđt phât
a ĩ
Vật liệu Săn phăm Mầu ban đđu
Hình 3.1. Hình ânh trín bản mỏng TLC điển hình vă câch xâc định giâ
trị Rf.
Rf ln có giâ trị nhở hơn 1 vă thay đổi tùy thuộc văo q trình triển khai băng mong như: tính chất của chất hấp phụ, thănh phần của dung mơi triín khai, chiều dăy của bâng mỏng, lượng mẫu chất chấm, nhiệt độ, điều kiện bêo hịa khí quyển.
Ưu điếm của phương phâp sắc ký lóp mỏng đó lă dễ dăng tiến hănh, thời gian triín khai sắc ký nhanh, lượng mẫu nhiều, hiệu ứng tâch tốt, nhạy hơn câc phương phâp khâc (hơn 20 lần so với sắc ký giấy); có thí phđn