Nhên hiệu Loại silica
gel
Cõ’ hat • (mm)
Diện tích bề • mặt (cm2/g)
Am icon (Danvers, MA) Si 60
Si 100 20-30 50-105 500(60 Ậ) 300(100 Ấ) J.T.Baker (Phillipsburg, NJ) Si 60 40-63 63-200 100-425 480 EM.Science / Merck Gibbstonin, NJ Si 40 Si 60 Si 100 25-40 63-200 40-63 63-100 15-40 675 (40 Ạ) 550 (60 Ấ) 420 (100 Ắ)) 1CN (Woelm) (Cleveland, OH) Si 60 10-18 10-35 18-32 32-63 32-100 63-100 63-200 500-600 Universal absorbents (Atlanta, GA) Si 60 18-32 32-63 63-100 53-200 100-200 500-600 Whatman (Clifton NJ) Si 40 13-24 37-53 75-40
Dung môi rứa cột:
dung mơi thích hợp, sao cho chất phđn cực nhất trong hồn hợp có giâ trị R|'> 0,35.
Ngoăi ra, sự khâc biệt về hằng số Rf của câc chất trong mẫu lă ARr
>0.15. Tuy nhiín, trơng một số trường hợp nếu ARfkhơng đạt u cầu trín thì có thể dùng giải phâp tăng chiều dăi cột vă giảm lượng mẫu phđn tích vă điều chỉnh hệ dung mơi.
Bảng 3.8. Âp dụng FC để tâch câc hợp chất thiín nhiín
Họp chất Nguồn thực vật Chất hấp phụ
Dung mơi rửa
Neolignan Piperfuto kasnra
Piperaceae SÌO2 Hexane- EtOAc Sesquiterpene Candle vdnterane Canellaceae
SiO2 Diethyl ether - Hexane
Capsaicinoid Onion RP-18 MeOFI
Alkaloid quinolizidine Lipinus argentens Fabaceae AI2O3 (Merck) Diethyl ether Ethyl methyl ether Nhồi cột:
Cột cho FC cũng được nhồi như sắc ký cột thông thường vă thường nhồi theo phương phâp nhồi cột khô. Sau khi dung môi chạy cột được đơ đầy văo cột thì mở van đe tạo âp suất trong cột. Mở khóa dí dung mơi được đuối ra khởi cột. Tiếp theo, cho mẫu văo cột sao cho tất cả mẫu thđm
đều văo lớp silica gel. Sau đó, dùng pipet rửa thănh cột. Cho dung mơi đầy văo cột, lắp hệ thong tạo âp suất trong cột, mở khóa vă hứng mầu. Trong q trình nhồi, cho mẫu văo cột vă chạy cột không đe cột bị khô.
3.3.4. Sắc kỷ nhanh - cột khô (Dry-column flash chromatography)
Sắc ký nhanh - cột khô dùng phễu lọc xốp bằng thủy tinh được gan trín
bình tam giâc. Bình năy nối văo hệ thống tạo âp suất thấp (thường lă dùng vịi nước hoặc mây bơm chđn khơng).
Chất hấp phụ thường dùng lă silica gel dùng cho SKLM tức loại có độ mịn hạt 40-15 mm hoặc AI2O3 dùng cho SKLM.
Cho từ từ chất hấp phụ văo phễu lọc ở trạng thâi khơ, lắp phễu lín trín bình tam giâc, gõ nhẹ văo thănh phễu để chất hấp phụ được nĩn đều, tạo thănh một khối đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt phang. Chiều cao của chất hấp phụ thường lă 5 cm.
Hòa tan mẫu văo một dung môi kĩm phđn cực, nạp văo cột, bật hệ thống tạo âp suất thấp, dung dịch mẫu sẽ được tham văo phần silica gel ở đầu cột thănh một lóp mỏng đều.
Cũng có thể nạp mẫu ở dạng khơ như khi chạy sắc ký cột thường. Sau đó, cho một lượng dung mơi vừa đủ lín bề mặt phễu, bật âp suất thấp đí hút hết dung mơi xuống bình tam giâc. Tắt hệ thống âp suất thấp, giót dung mơi trong bình hững sang bình khâc. Lặp lại nhiều lần vă kết họp với việc tăng độ phđn cực của dung mơi. Theo dõi q trình giải ly vă thay đồi hệ dung mơi thích hợp bằng sắc ký lớp mỏng như sắc ký cột thường.
Ưu điểm của sắc ký cột nhanh vă sắc ký nhanh - cột khơ lă:
- Kỹ thuật năy dùng ít chất hấp phụ vă ít dung mơi hơn, thời gian chạy ngắn hơn so với sắc ký cột thông thường.
3.4. Sắc ký trao đối ion
Sắc ký trao đổi ion (IEC) cho phĩp tâch câc phđn tử có the ion hóa trín cơ sở sự khâc biệt về tính chất điện tích. Khả năng xử lý mẫu lớn, khả năng ứng dụng rộng rêi (đặc biệt đối với protein vă enzyme), chi phí vừa phải, khả năng phđn giải mạnh mẽ, dễ mở rộng quy mơ vă tự động hóa đê khiín nó trở thănh một trong những phương phâp sac ký lỏng linh hoạt nhđt vă được sử dụng rộng rêi. sâc ký trao đối ion lă q trình trong đó dung dịch của một chất điện ly được cho tiếp xúc với nhựa trao đôi ion vă những ion hoạt động trín bề mặt của nhựa được thế chỗ bằng những ion có cùng điện tích của dung dịch chất điện ly.
3.4.1. Nguyín tắc cơ bản
Với nguồn gốc từ những năm 1940, sắc ký trao đối ion (IEC) được tạo ra đề tâch câc phđn tử tích điện hoặc ion hóa khâc nhau. Câc nhă hóa học vă hóa sinh đều sử dụng kỹ thuật năy đế tinh chế protein, enzyme, khâng the, peptite, acid amin vă acid nucleic, cũng như carbohydrate đơn giản hơn vă câc hợp chất hữu cơ. Khả năng xử lý mẫu lớn, khâ năng ứng dụng rộng rêi, chi phí vừa phải, khả năng phđn giải mạnh mẽ vă dễ dăng mờ rộng quy mơ vă tự động hóa đê khiến nó trở thănh một trong những ứng dụng linh hoạt vă được sử dụng rộng rêi nhất. Giống như câc dạng khâc của LC dựa trín cột, kỹ thuật năy dựa trín pha động vă pha tĩnh, trước đđy thường lă một hệ thống đệm nước trong đó hỗn hợp rửa giải được đưa văo vă loại thứ hai thường lă chất nền hữu cơ trơ được tạo dẫn xuất về mặt hóa học với câc nhóm chức có thể ion hóa mang một phản điện tích trâi dđu. Câc phản ứng năy tồn tại ỏ’ trạng thâi cđn bang giữa pha động vă pha tĩnh, lăm phât sinh hai định dạng IEC có thể có, đó lă trao đoi anion vă cation. Câc đối ion có thể hơn đổi bao gồm proton (H+), nhóm hydroxit (OEE), ion đơn ngun tử tích điện đon (Na+, K+, cr), ion đon ngun tử tích điện đơi (Ca2+, Mg2+) vă ion vơ cơ đa ngun tử (SƠ42-, PO43-), cũng như base hữu cơ (NR2H1) vă acid (COO-).
Sự ion hóa phụ thuộc văo độ pH của câc nhóm chất điện ly (acid hoặc base yếu) có thế truyền điện tích đm hoặc dương thuần trín câc phđn tử sinh học, sau dó cho phĩp tâch chúng khỏi nhau thơng qua IEC. Điíu năy có thể đượ’c giải thích bằng câch lấy lăm ví dụ về sự phđn tâch hỗn hợp câc protein. Trong suốt quâ trình IEC, pH của pha động sẽ xâc định điện tích thực trơn cả nhóm chức nền vă trín câc protein riíng lẻ trong hỗn hợp mẫu.
Bản chđt polyampholyte của protein có nghĩa lă chúng có thể mang cả điện tích dương vă đm, phan lớn lă do sự ion hóa của chuỗi bín lysine vă arginine vă phần sau lă do sự ion hóa chuỗi bín của aspartate vă glutamate. Theo ngun tắc chung, một protein sẽ có điện tích đm thực trín điểm đẳng điện hoặc pl của nó (tức lă độ pH tại đó protein có điện tích thực bằng khơng) vă ngược lại. Đương nhiín, câc protein khâc nhau có thề có giâ trị pl khâc nhau vă do dó, điện tích thực khâc nhau ở bất kỳ độ pH nhất định năo. Do đó, pH của pha động có thế được chọn để đảm bảo răng điện tích thực cùa protein quan tđm trong hỗn hợp đối nghịch với điện tích của nhóm chức nền, đảm bảo rang nó sẽ thay thế nhóm chức phản diện vă liín kết với chất nền (hấp phụ). Ngược lại, câc protein “tạp nhiễm'’ tích điện trâi dđu sẽ khơng được giữ lại.
3.4.2. Câc tiíu chí lựa chọn câc điều kiín ỉ EC• • •
3.4.2. ỉ. Lựa chọn chất nền trao đỏi ỉon
Việc lựa chọn chất nền trao đôi ion phù hợp có lẽ lă khía cạnh quan trọng nhđt cùa bất kỳ giao thức trao đối ion năo vă dựa trín câc yếu tố khâc nhau:
- Mục đích của q trình tinh chế: điều năy có thề lă cơ đặc vă ổn định protein mục tiíu trong bước bắt đầu, để loại bỏ câc tạp chất lớn trong bước trung gian, hoặc để đạt được độ tinh khiết cao trong bước tinh sạch cuối cùng.
- Điện tích/cường độ chất trao đối ion mong muốn: Câc nhóm chức năng trao dơi ion được chia thănh hai loại điện tích. Ví dụ, câc nhóm chức diethylaminoethyl tích điện dương (DEAE) vă amoni bậc bốn (Q) thường dược sử dụng trong sắc ký trao đối anion, trong khi câc nhóm carboxymethyl (CM), sulfomethyl (S) vă sulfopropyl (SP) tích điện đm lă câc chất trao đơi cation điển hình. Cả hai loại bộ trao đổi có thể được phđn loại thănh “mạnh” hoặc “yếu”. Câc chất trao đổi ion mạnh được ion hóa hoăn toăn trong một phạm vi pH lăm việc rộng (nghĩa lă khơng bị mất hoặc tăng điện tích vói pH thay đối), trong khi câc chất trao đổi ion yếu chỉ bị ion hóa một phần trong một phạm vi pH hẹp (nghĩa lă, điện tích có thí thay đối đâng kể với pH). Do đó, với câc chất trao đổi ion mạnh, câc protein riíng lẻ có thề hấp phụ văo một số vị trí trao đổi, thường có câc điều kiện
được sử dụng để phât triển ban đầu vă tối ưu hóa câc quy trình tinh sạch (vă đí liín kết với câc protein có giâ trị pl nằm về phía cực hơn cua thang pH). Ngược lại, chất trao đổi ion yếu linh hoạt hơn về tính chọn lọc vă lă lựa chọn phơ biến hơn đí tâch câc protein vẫn giữ được chức năng cùa chúng trong phạm vi pH 6-9, cũng như đối với câc protein khơng bín có thí u cầu điều kiện rửa giải nhẹ.
- Thuộc tính mẫu: Việc lựa chọn nhóm chức năng trao đơi phù họp nhất cho quâ trình tinh chế cũng sẽ được quyết định bởi câc đặc tính sinh hóa của protein mục tiíu như độ ổn định pl vă pH.
3.4.2.2. Lựa chọn câc điểu kiện đệm
Đí ngăn chặn bđt kỳ sự thay đoi năo trong điện tích chất nền vă protein, việc duy trì pH pha động khơng đổi trong suốt q trình IEC lă cần thiết đí trânh sự dao động pH có thí xảy ra khi giâi phóng cả protein vă chất trao đôi (đặc biệt nếu lă ion H+ hoặc OH“) văo pha động. Một số yếu tố quan trọng quyết định sự lựa chọn của bộ đệm pha động:
- Điện tích đệm: lon đệm khơng được tương tâc với câc nhóm chức năng trao đổi ion (tức lă, chất đệm tích điện dương nín được sử dụng trong trao đơi anion vă ngược lại). Ví dụ, bộ đệm Tris thường được sử dụng với bộ trao đôi DEAE, trong khỉ bộ đệm phot phât vă acetate thường được sử dụng với bộ trao đối CM
- Độ bền đệm: Độ bền đệm tối thiếu được khuyến nghị cho quâ trình trao đơi ion lă khoảng 10 mM trong vịng 0,3 đơn vị pH của hăng sơ phđn ly đệm hoặc pKa (tức lă pH tại đó khả năng đệm mạnh nhất).
- PH đệm: Cuối cùng, nín chọn pH đệm cho phĩp protein quan tđm duy trì ơn định, đồng thời cho phĩp nó liín kết thuận nghịch với chất nền. Nó cũng phải đù gần với pH mă tại đó protein bắt đầu phđn ly khỏi cột để ngăn chặn sự cần thiết phải điều chỉnh pH hoặc cường độ ion trong quâ trình rửa giải đen câc mức có thể lăm mất ổn định protein.
3.4.2.3. Lụa chọn câc điển kiện hấp phụ vă rua giai
Pha động có thể được điều chỉnh để đạt được sự hấp phụ/rửa giải tối ưu của câc protein mục tiíu:
- Độ pH: pH của pha động có thể được thay đối để có lợi cho việc hấp phụ hoặc rửa giải protein. Nói chung, độ pH được chọn sẽ chỉ cho phĩp liín kít với protein mục tiíu. Đđy thường lă khoảng 1 đơn vị pl-1 trín hoặc
dưới pl của protein mục tiíu. Sự khâc biệt lớn hơn về pH sẽ dẫn đến liín ket protein mạnh hơn, yíu cầu điều kiện rửa giải mạnh hơn vă giđm độ
phđn giải mẫu vă phục hồi hoạt tính của protein mục tiíu. Sự thay đổi pH cũng có thể được sử dụng để tạo ra sự giải hấp của protein mục tiíu (pH giảm trong trường hợp chất trao đổi anion vă ngược lại).
Bảng 3.9. Câc dung dịch đệm thông dụng
Dung dịch đệm Giâ trị pH
Acid citric - Citrat natri 2,0-6,0
Acid acetic - Sodium Acetate 4,2-5,4
Tris-acid phosphoric 5,0-10,0
Sodium hydrogen phosphate 5,0-7,4
Acid boric - borax 6,8-10,0
Tris-acid chlohidric 7,5-9,5
Amoniac - Ammonium chloride 8,2-10,2
Borax - Natri hydroxide 10,6-11,6
Natri bicarbonate - Natri hydroxide 9,0-12,0
Triethanolamin 6,7-8,7
- Cường độ ion: Cường độ ion của pha động cũng có thể được sử dụng đế kiểm sôt sự hấp phụ vă rửa giải protein mục tiíu. Theo nguyín tắc chung, nín dùng cường độ ion cao nhất cho phĩp hấp phụ (ví dụ, 20-50 mM NaCl) vă cường độ ion thấp nhất sẽ cho phĩp rửa giải.
3.4.2.4. Lựa chọn kiíu rửa giải
ỉ lai kiíu rứa giải có thí được xâc định:
- Rửa giải đẳng dòng: Với rửa giải đẳng dòng, một loại đệm dưy nhất được sử dụng trong toăn bộ quâ trình phđn tâch. Câc thănh phần mẫu (bao
gồm cả protein mục tiíu) chỉ được hấp thụ lỏng lẻo/khơng hoăn toăn văo
chất nền cột. Vì câc protein riíng lẻ sẽ có hệ số phđn bố khâc nhau, nín sự phđn tâch đạt được nhờ tốc độ di chuyển tương đối của chúng qua cột. Do dó. đế đạt được độ phđn giải tổi ưu của câc thănh phan mẫu, nín dùng một
thể tích mẫu nhở (1-5% thế tích tầng) vă cột trao đổi dăi (tỷ lệ đường kính:
muốn văo nền cột, địi hỏi phải thay đối câc điều kiện rửa giải đế đạt dược sự giải hấp thụ của nó.
- Rửa giải gradient: Với q trình rửa giải gradient, câc biến thí hín tục hoặc không liễn tục (theo từng bước) về cường độ ion hoặc pH của dung dịch rửa giải được sử dụng để thúc đấy quâ trình giải hap protein mục tiíu. Mặc dù gradient theo từng bước đơn giản hơn về mặt kỹ thuật, nhưng gradient liín tục thường cho độ phđn giải tốt hơn.
3.4.3. Câc loại nguyín liệu để lăm nhựa trao đổi ion vă đặc tính của nó
Câc loại ngun liệu để lăm nhựa trao đổi ion bao gồm những hạt khơng tan trong nước, trín bề mặt của những hạt có mang những nhóm chức có điện tích dương hoặc điện tích đm. Câc đối-ion tự do sẽ liín kít với những nhóm chức năy.
Câc ngun liệu lăm nhựa trao đổi ion có the lă polysaccharid hoặc resin tổng họp.
Có 3 ngun liệu chính: nhựa polystyrene, câc polymer carbohydrate vă silica gel.
- Nhựa polystyrene lă ngun liệu thơng dụng nhất, đó lă polystyrene hoặc metacrylate mang nhiều nhóm thế mang điện tích. Mạng nhựa rắn chắc vă bền về mặt hóa học. Mạng polystyrene chịu được khơng pH từ 1 - 14, còn mạng metacrylat chịu đưọ’c khoảng pH từ 2-10. Nhựa thông dụng nhất lă Dowex, được tống hợp từ styren với divyninbenzen (DVB) đế nối mạng ngang.
- Polymer carbohydrat: Hạt nhựa lă câc polysaccharid có tính âi nước (hydrophilic) nín thường được sử dụng đí tâch câc protein.
- Một loại nhựa thông dụng lă Sephadex. Sephadex lă dextran dược nối mạng ngang tạo mạng 3 chiều, trong đó câc nhóm chức hoạt động được gắn lín dextran ngang qua những cầu nối ether. Nhựa ở dạng hình cầu nín cho dòng chảy qua giải ly khâ dễ. Nhựa trương nỏ’ trong nước nín dễ nạp văo cột.
Có 3 loại nhựa Sephadex:
- Sephadex 25 có độ nối mạng ngang chặt chẽ, hạt gel trương nở ít, phù hợp để tâch câc hợp chất thiín nhiín.
- Sephadex LH20: Sephadex LH được tạo thănh do acyl hóa hoặc akyl hóa một số nhóm -OH của SephadexG. Do đó nó vừa có tính thđn dầu, vừa có tính thđn nước. Sephadex LFI20 được akỵl hóa từ Sephadex G25. Sephadex LH20 lă một loại chất mang trong sắc kí được thiết kế đế phđn lập những hợp chất thiín nhiín kĩm tan hoặc không tan trong nước như steroid, terpenoids, lipids vă peptid có phđn tử lượng thấp.
- Sephadex 50 có độ rỗng lớn hon, thường được dùng để tâch câc đại phđn tử hữu cơ có trọng lượng lớn hơn 30.000 dalton như câc phđn tử protein hay những phđn tử dễ bị hư hại. Ngoăi ra cịn có loại nhựa Sepharose (lă agarose nối mạng ngang) vă cellulose.
Gần đđy trín thị trường có loại hạt nhựa tạo bởi silica. Ngược lại với những hạt nhựa trín, hạt nhựa silica khơng trương nở theo thănh phđn dung môi sử dụng. Hạt nhựa có nhược điểm lă cần có sự ổn định ve pH, nhựa bền trong khoảng pH=2-7,5.
Bảng 3.10. Câc đặc tính tống quât của câc loại nhựa trao đối ion