I.8.2.1. Kết tủa protein bằng cách nâng nhiệt độ
Nâng nhiệt là phương pháp đơn giản nhất để thu hồi protein hịa tan trong dung dịch. Đặc điểm của phương pháp này là đơn giản và dễ thực hiện. Tuy nhiên với một thể dịch protein hịa tan quá lớn thì phương pháp này rất tốn kém về kinh tế.
Cơ sở khoa học:
Ở trạng thái bình thường, các protein đều mang điện tích dương hoặc âm. Khi phân tán trong nước thì phân tử của nĩ sẽ hấp thụ các phân tử nước bởi các phần cĩ cực và tạo thành một lớp hidrat hĩa bao bọc xung quanh. Khi đun nĩng sẽ phá vỡ lớp vỏ điện tích và khả năng hidrat hĩa của protein: nhiệt độ tăng lên làm tăng chuyển động nội tại của các phân tử protein, phá vỡ các liên kết hydrogen giữa phân tử protein
với phân tử nước, làm giảm khả năng hấp thụ nước của protein. Do đĩ sẽ làm tăng liên kết giữa các protein với nhau. Đun nĩng sẽ gây biến tính và tập hợp protein làm cho bề mặt của phân tử protein bị giảm. Các phân tử này tạo thành từng cụm lớn dần, tăng khối lượng và lắng xuống.
Mặt khác, dịch thải của các nhà máy chế biến thường cĩ màu và mùi khĩ chịu, do đĩ đun nĩng cịn gĩp phần làm bay hơi các chất cĩ mùi tanh và phần nào khử mùi cho sản phẩm bột protein thu hồi được. Ngồi ra, đun nĩng cịn tiêu diệt hoặc ức chế một số VSV và enzyme gây thối Vì vậy sẽ tăng thời gian bảo quản sản phẩm bột protein ướt trước khi đem vào cơng đoạn sấy.
I.8.2.2. Kết tủa protein bằng muối
Đây là cách khá phổ biến để thu hồi protein hịa tan trong dung dịch. Biện pháp này đơn giản, tuy nhiên để thực hiện thì cần một lượng muối khá lớn và gây tốn kém. Cơ sở khoa học:
Khả năng hịa tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại protein, pH, nhiệt độ, nồng độ muối. . .Đặc biệt, bản chất và nồng độ ion cĩ ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ nước và khả năng hịa tan của protein. Giữa nước, muối và các nhĩm bên acid amine của protein thường cĩ một mối quan hệ cạnh tranh.
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng ( thuật ngữ tiếng Anh làsalting in). Tuy nhiên, khi nồng độ muối cao, tính tan của protein lại giảm mạnh ( thuật ngữ tiếng Anh làsalting out)
Giả thuyết salting in của protein ở nồng độ muối thấp được giả thích bằng thuyết Debye-Huckel như sau: trong dung dịch, phân tử protein được bao bọc bởi các ion muối mang điện trái dấu. Kết quả là làm tăng các phân tử protein mang điện tích, tăng khả năng hidrat hĩa, từ đĩ làm tăng tính tan của protein. Giả thuyết này cũng dự đốn rằng độ tan của protein là một hàm logarit và hàm này tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch.
Mặt khác, tính chấtsalting out của protein trong dung dịch cĩ nồng độ muối cao được giả thích bởi Kirkwood. Sự cĩ mặt của nhiều ion muối trong dung dịch làm giảm khả năng solvate hĩa, dẫn đến làm giảm tính hịa tan của protein, vì vậy protein bị kết tủa và lắng xuống.
Ở nồng độ muối cao, độ hịa tan được tính theo phương trình thực nghiệm của Cohn:
log S = B - KI trong đĩ:
S: độ hịa tan của protein
B: hằng số (phụ thuộc vào loại protein, pH, nhiệt độ)
K: hằng số salting out (phụ thuộc vào pH, độ đồng nhất và hàm lượng muối cĩ trong dung dịch)
I: cường độ ion của muối
Bằng cách sử dụng các khoảng nồng độ muối thích hợp, chúng ta cĩ thể làm kết tủa các protein mong muốn từ dung dịch protein hịa tan ban đầu. Ngồi ra, khi phân tử lượng của protein tăng, lượng muối cho vào để kết tủa protein giảm xuống. Hiệu quả kết tủa protein của các anion muối khác nhau là khác nhau và được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate.
I.8.2.3. Kết tủa protein bằng các non-ionic Polymer
Cơ sở khoa học:
Cách kết tủa protein này được thực hiện bằng cách thêm một Non-ionic Polymer vào dung dịch protein. Nguyên lý của phương pháp này là khi thêm Non-ionic Polymer vào sẽ gây ra sự cạnh tranh nước giữa các polymer này với các protein làm cho số lượng các phân tử nước tương tác với protein giảm xuống. Các Non-ionic Polymer thường được sử dụng nhất là dextran và polyethylene glycol.
Điều này được giải thích như sau: μi = μo
i+ RT(ln mi + fiimi + fijmj) Trong đĩ:
μoi: điện thế hĩa học tiêu chuẩn của phần tử i μi : điện thế hĩa học của phần tử i
R : hằng số khí T : nhiệt độ tuyệt đối
mi, mj : nồng độ mol của phần tử i và j fii : hệ số tương tác của phần tử i
fij : hệ số tương tác giữa phần tử i và phần tử j
Loại Non-ionic Polymer thêm vào dung dịch protein phụ thuộc vào khối lượng phân tử của protein. Đặc biệt hiệu suất của phương pháp này sẽ tăng lên khi cho Non- ionic Polymer vào tại giá trị pH mà gần với giá trị pI của đa số protein trong dung dịch nhất.
Ngồi ra người ta cịn sử dụng các dung mơi hữu cơ khác như acetone và ethanol. Các dung mơi hữu cơ khác khơng được sử dụng phổ biến vì chúng quá mạnh và gây biến tính protein. Với phương pháp này cần chú ý những điều sau:
- Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả và làm giảm biến tính protein
- Nồng độ ion thích hợp là 0.05 – 0.2M. Nồng độ cao quá sẽ gây dư thừa dung mơi và khĩ khăn cho quá trình tách chiết.
- Trọng lượng phân tử của protein hào tan càng cao thì lượng dung mơi cần cho quá trình tủa càng ít. Theo Scopes (1982), khi tủa bằng acetone thì tuân theo cơng thức sau:
[(v/v)%] = 1.8- 0.12 ln [MW] Trong đĩ:
(v/v)%] : thể tích dung mơi cần cho quá trình tủa (tính theo %) MW : khối lượng phân tử của chất tan
- Nếu cĩ mặt đồng thời hai loại protein trong dung dịch, tính tan của một protein sẽ giảm vì sự cĩ mặt của protein kia.
- Kết tủa thu được thường khĩ tan trở lại vì đã bị biến tính. Tuy nhiên, thuận lợi của phương pháp tủa bằng Non-ionic Polymer là sản phẩm protein thu được bền và cĩ thể sưe dụng được ở nhiệt độ phịng.
I.8.2.4. Kết tủa protein bằng các dung mơi hữu cơ
Cơ sở khoa học:
Khi thêm dung mơi hữu cơ vào trong dung dịch sẽ làm cho hằng số điện mơi của dung dịch giảm xuống. Mối quan hệ giữa độ tan và hằng số điện mơi được thể hiện qua hàm số sau: D D RT A S S Ln w w 1 1 ( * ) Trong đĩ:
S : độ hịa tan protein trong dung mơi hữu cơ
w
S : độ hịa tan protein trong nước A : hằng số
R : hằng số khí T : nhiệt độ tuyệt đối
w
D : hằng số điện mơi của nước
D : hằng số điện mơi của dung dịch protein sau khi bổ sung dung mơi hữu cơ Từ hàm số trên cho thấy : nếu hằng số điện mơi của dung dịch giảm khi bổ sung thêm dung mơi hữu cơ, thì độ tan của protein cũng giảm, do đĩ tạo ra kết tủa. Tuy nhiên, các dung mơi hữu cơ lại cĩ ái lực với bề mặt kị nước của protein, do đĩ chúng làm biến tính protein trong quá trình tủa. Do đĩ, khi tiến hành kết tủa, dung mơi thường được sử dụng ở nồng độ thấp. Chỉ cĩ các dung mơi như 2-methyl-2,4-pentane diol (MPD), Dimethyl Sulfoxide (DMSO) và ethanol cĩ thể được sử dụng ở nồng độ cao.
I.8.2.5.Kết tủa protein bằng ion kim loại
Cơ sở khoa học :
Trong phương pháp tủa bằng ion kim loại, ion sẽ gắn với một phần của phân tử protein. Thuận lợi của phương pháp này là cĩ thể kết tủa được protein trong một dung dịch rất lỗng. Các ion thường sử dụng cĩ thể chia làm 2 nhĩm:
- Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, và Cd2+ sẽ gắn chặt với các carboxylic acid và các hợp phần chứa nitrogen.
- Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+, và Pb2+ chủ yếu gắn với các carboxylic acid. - Các ion như Ag+, Hg2+, và Pb2+...chủ yếu gắn chặt với các nhĩm chứa lưu
huỳnh.
Tuy nhiên, khĩ khăn của phương pháp kết tủa protein bằng các ion kim loại là phải tìm cách tách các kim loại ra khỏi chế phẩm protein thu được, đặc biệt là các kim loại nặng cĩ nhiều độc tính như Ag+, Hg2+,và Pb2+...
I.8.2.6. Kết tủa theo phương pháp điểm đẳng điện
Cơ sở khoa học:
Acid amin và protein cĩ tính chất lưỡng tính, tức là vừa cĩ tính chất acide, vừa cĩ tính chất base. Theo thuyết Brenxtat, một chất cĩ tính chất acide cĩ khả năng cho proton, phản ứng với base tạo thành muối. Tính chất base thể hiện ở khả năng nhận proton, kết hợp với acide tạo thành muối. Phân tử acide amine đồng thời cĩ cả nhĩm amin và nhĩm carboxyl.
Trong dung dịch, ở pH trung tính, acide amine tồn tại chủ yếu ở dạng ion lưỡng cực, chỉ cĩ 1% ở dạng trung hịa. Ở dạng ion lưỡng cực, nhĩm carboxyl bị phân ly, nhĩm amin bị proton hĩa. Trạng thái ion hĩa của các nhĩm này tùy thuộc vào pH mơi trường. Trong mơi trường acide, nhĩm carboxyl khơng bị ion hĩa, nhĩm amine bị proton hĩa. Ngược lại, trong mơi trường kiềm, nhĩm carboxyl bị ion hĩa, nhĩm amin khơng ion hĩa. Ở một pH nào đĩ, tổng số điện tích trong phân tử protein bằng 0, pH
này được gọi là pH đẳng điện của acide amine , kí hiệu là pI (Isoelectric point) của acid amin.
Tương tự như acid amin, protein cũng là chất điện li lưỡng tính vì trong phân tử protein cĩ nhiều nhĩm phân cực của mạch bên (gốc R) của acide amine. Trạng thái điện tích của nhĩm này cũng tùy thuộc pH của mơi trường. Và cũng như acide amine, mỗi protein cũng cĩ một điểm đẳng điện riêng, kí hiệu là pI của protein.
Bảng 1.12. Giá trị pHi của một số loại protein [2]
Loại protein pI Loại protein pI
Albumin trứng 4,6 Hemoglobine 6,8 Caseine 4,7 Ribonuclease 7,8 Serumalbumine 4,9 Tripsine 10,5 Gelatine 4,9 Xitocrome 10,6 Globuline 5,2 Prolamine 12,0
Tại giá trị pH của mơi trường gần điểm pI của của đa số protein trong dung dịch, phân tử protein mang điện rất yếu hoặc khơng mang điện. Do đĩ, lớp vỏ hidrad hĩa bên ngồi phân tử protein bị loại bỏ, các phân tử protein sẽ kết tụ với nhau tạo thành khối lớn và tách khỏi dung dịch.
I.9. KHÁI QUÁT VỀ SỰ KEO TỤ VÀ TẠO BƠNG [16]
Sự keo tụ và sự tạo bơng là các quá trình hĩa lí thường được sử dụng để tách các chất hịa tan và các chất màu trong nước hoặc nước thải.
Sự keo tụ là quá trình làm mất tính bền vững của hệ keo trong dung dịch, kết quả là sự tập hợp của các phần tử rất nhỏ lơ lửng thành khối lớn hơn do sự thay đổi tính chất lí hĩa trên bề mặt của các phần tử này.
Sự tạo bơng là quá trình liên kết của các phần tử nhỏ trong dung dịch thành khối lớn hơn nhờ các cầu nối ion hay polymer.
I.9.1. Tính bền vững của các chất keo trong dung dịch
Các phần tử như protein hịa tan, vi khuẩn, oxit kim loại. . . cĩ thể lơ lửng trong dung dịch nếu tổng của lực solvate hĩa và lực tương tác bề mặt giữa các phần tử lớn hơn trọng lực của chúng. Nĩi chung, trọng lực là khơng đổi đối với một hệ keo cho trước, song sự solvat hĩa và lực tương tác giữa các phân tử phụ thuộc rất lớn vào tính chất lí hĩa của dung dịch, tính chất bề mặt của các phần tử và kích thước của chúng. Kích thước các phần tử càng nhỏ, diện tích bề mặt của chúng càng lớn, do đĩ sự solvate hĩa tăng lên. Kết quả là hệ keo bền vững hơn.
Bề mặt của các hạt keo thường mang điện tích âm trong dung dịch cĩ pH kiềm và mang điện tích dương trong dung dịch cĩ pH acid. Việc thêm vào các chất điện li đa hĩa trị (như CaCl2) hoặc các polymer hữu cơ (như chitosan) cĩ thể làm mất tính bền vững của hệ keo. Các polymer hữu cơ cĩ phân tử lượng lớn thường được sử dụng để làm sạch nước và xử lí nước thải.
I.9.2. Tốc độ keo tụ - tạo bơng
Quá trình keo tụ và tạo bơng bao gồm tương tác giữa các phần tử với nhau. Sự tương tác giữa các phần tử cĩ thể theo 3 cơ chế sau:
- Sự chuyển động ngẫu nhiên do sự phân tán của các phần tử hay chuyển động Brown.
- Gradient vận tốc chảy lớp cho phép các phần tử gần kề dịng chảy tương tác với nhau.
- Tốc độ lắng khác nhau, trong đĩ các phần tử lắng chậm bị tương tác bởi các phân tử lắng nhanh hơn.
Tốc độ tập hợp của các phần tử được xây dựng dựa trên hai hệ quả sau:
- Ban đầu các phần tử phân tán kiểu đơn lẻ, tức là ban đầu chúng cĩ cùng kích thước.
- Xác định tốc độ keo tụ - tạo bơng giới hạn trong các khoảng thời gian ngắn mà đường kính của các phần tử thay đổi khơng nhiều.
Sự keo tụ theo chuyển động Brown cĩ thể giải thích bằng động lực học và được biểu diễn bằng hàm sau: dv = - dt dN - k N2 dt dN P (1) Trong đĩ: N : nồng độ của các phần tử P
k : hằng số tốc độ được tính theo cơng thức sau:
P k = P* 3 4 T (2) Với: : hằng số Boltzman (1.38 * 10−16 dyne. cm/°K) T : nhiệt độ tuyệt đối (oK)
: độ nhớt của nước (8.95 * 10-3dyne. sec/cm2 )
P
: hiệu suất tương tác giữa các phần tử theo động lực học (P≤ 1) Khi nhiệt độ nước ở 20oC thì P= 1, tính được kP= 5 * 10−12cm3/s.
Hệ keo cĩ các phần tử kích thước 1 µm hay nhỏ hơn tuân theo cơng thức trên. Quá trình khuấy cĩ thể làm tăng sự tập hợp do làm tăng sự va chạm giữa các phần tử. Sự tập hợp là kết quả của gradient vận tốc được gọi là tập hợp theo động lực học kiểu ortho (orthokinetic) . Quá trình tập hợp này cĩ thể điều chỉnh bằng mức năng lượng đưa vào và được biểu diễn bằng hàm số sau:
dv = - dt dN mà - 3 2 0 3 2 Gd N dt dN (3)
Trong đĩ:
d : đường kính của các phần tử G : gradient vận tốc chính (sec-1)
0
: hiệu suất tương tác giữa các phần tử theoorthokinetic (0≤ 1)
Nếu thể tích của các phần tử rắn là khơng đổi trong quá trình tập hợp, thể tích riêng phần của các hạt keoφ, cĩ thể tính bằng: N d N do 3 0 3 6 6 (4) Trong đĩ: 0
d là đường kính của các hạt ban đầu (trước khi tập hợp)
0
N là nồng độ ban đầu của các phần tử (trước khi tập hợp)
Từ phương trình (3) và (4) chúng ta cĩ được phương trình tốc độ lắng theoorthokinetic
như sau: - dt dN = oGN 4 (5)
Vậy tổng tốc độ của quá trình keo tụ - tạo bơng do sự giảm nồng độ của các phần tử chất keo ở bất kì kích thước nào cĩ thể được tính bằng tổng của phương trình (1) và phương trình (5).
I.10. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN [4]
Chitosan là dẫn xuất đề axetyl hố của chitin, trong đĩ nhĩm (–NH2) thay thế nhĩm (-COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glicozit, do vậy chitosan cĩ thể gọi là poly b- (1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly b-(1-4)-D- glucozamin. Cấu trúc của chitosan như sau:
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của chitosan
Cơng thức phân tử :[C6H11O4N]n Phân tử lượng : M= (161.07)n
I.10.1. Đặc điểm của chitosan :
Tính chất vật lí:
Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng vảy trong suốt, dạng bột cĩ màu vàng nhạt hay màu trắng ngà, khơng mùi, khơng vị.
Chitosan cĩ nhiệt độ nĩng chảy 309 – 310oC, trọng lượng phân tử trung bình từ 10.000 – 500.000 dalton tùy loại. . Loại Chitosan cĩ trọng lượng phân tử trung bình (M) từ 200.000 đến 400.000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và thực phẩm.
Tính chất hĩa học:
Chitosan cĩ tính kiềm nhẹ, khơng tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng hồ tan trong mơi trường acid lỗng (pH=6 - 6.5) tạo dung dịch keo trong.