Nhà nghiên cứu Civit (1982) và cộng sự đã nghiên cứu việc tách các chất hữu cơ hịa tan trong nước bằng cách thay đổi nhiệt độ và pH để tạo ra sự kết tủa protein
trong nước thải của nhà máy bột cá. Kết quả nghiên cứu cho thấy lượng protein thu hồi được nhiều nhất khi gia nhiệt ở nhiệt độ trên 65oC và pH ở khoảng 5,6 – 5,9. Khi tăng nhiệt độ lên trên 75oC thì khơng tăng hiệu suất thu hồi.
Hiện nay nhiều nơi trên thế giới đã tiến hành các nghiên cứu sử dụng các chất kết đơng để xử lí làm keo tụ protein trong nước thải thủy sản. Các chất đơng tụ thường được sử dụng là các muối của nhơm Al2(SO4)3, NH4Al(SO4)2…và các muối của sắt như FeCl3, Fe2(SO4)3. Genovese (1998) đã nghiên cứu tách protein từ nước thải thủy sản. Chất kết đơng được sử dụng là FeCl3 hàm lượng 10mg/l, Al2(SO4)3 hàm lượng 40mg/l. Mặt khác, việc sử dụng các polymer hữu cơ vào để trợ giúp quá trình keo tụ và trợ lắng cũng đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy sử dụng các polymer hữu cơ này làm tăng hiệu suất thu hồi lên đáng kể. Năm 2005, Wibowo và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các loại chitosan lên hiệu quả thu hồi protein từ nước rửa surimi. Hiện nay nhiều nhà khoa học cũng bắt đầu nghiên cứu sử dụng polimer aluminium chloride (PAC), một loại phèn nhơm mới để tăng hiệu quả quá trình trợ lắng thu hồi protein.
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
II.1.1. Nguyên liệu chính
Nguyên liệu chính của đề tài nghiên cứu thu hồi protein từ máu cá là dịch thải máu cá tra được lấy từ nhà máy chế biến cá Tra fillet đơng lạnh Thái Bình Dương của Cơng ty cổ phần Nam Việt, An Giang (NAVICO).
Hình 2.1. Dịch thải máu cá khi tiếp nhận tại Nha Trang
Dịch thải máu cá được cấp đơng tại kho cấp đơng của nhà máy ở nhiệt độ - 22oC, sau đĩ cho vào thùng xốp cách nhiệt và vận chuyển ra Nha Trang. Tại trường Đại Học Nha Trang, máu cá được bảo quản tại kho bảo quản đơng của Bộ mơn Kĩ thuật lạnh ở nhiệt độ - 20oC. Vì vậy, máu cá luơn được giữ ở trạng thái đơng lạnh và cĩ tính chất gần giống với dịch máu cá lúc thu gom tại nhà máy.
II.1.2. Hĩa chất sử dụng
Thí nghiệm sử dụng các hĩa chất sau: - Acid acetic 1%
- Chitosan được cung cấp bởi phịng Hĩa sinh – Vi sinh thực phẩm, Đại học Nha Trang với độ deacetyl 85%. Sau đĩ, chitosan rắn được pha trong acid acetic 1% thành dung dịch chitosan 1 %
- Dung dịch CaCl2 1%
II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Dịch thải máu cá Tra Nâng nhiệt Đánh giá và xác định nhiệt độ thích hợp Bổ sung CaCl21% làm chất trợ lắng Mẫu đối chứng Đánh giá và xác định nồng độ CaCl2thích hợp Bổ sung chitosan 1% làm chất keo tụ và tạo bơng
Đánh giá và xác định nồng độ chitosan thích hợp Mẫu đối chứng
Đánh giá, xác định nhiệt độ, nồng độ CaCl2 và nồng độ chitosan thích hợp
II.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết
II.2.2.1. Bố trí thí nghiệm thăm dị để khảo sát nhiệt độ thích hợp kết tủa protein trong dung dịch máu cá
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm thăm dị để khảo sát nhiệt độ thích hợp kết tủa protein trong dung dịch máu cá
Thí nghiệm được tiến hành như sau: chuẩn bị 7 bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình chứa 100 ml dịch thải máu cá. Sau đĩ, nâng nhiệt các mẫu dịch máu cá lần lượt ở 40oC, 50oC, 55oC, 60oC, 65oC, 70oC, 75oC trong bể ổn nhiệt. Thời gian xử lí nhiệt là 5 phút, khơng tính thời gian tăng nhiệt. Trong khi xử lí lắc đều dịch máu cá. Sau khi nâng nhiệt xong, lọc thu lấy phần dịch và xác định hàm lượng protein cịn lại theo phương pháp Microbiuret.
II.2.2.2. Bố trí thí nghiệm thăm dị để xác định nồng độ CaCl2 thích hợp nhằm tăng hiệu quả thu hồi protein trong dung dịch máu cá sau nâng nhiệt
Sau khi nâng nhiệt đến nhiệt độ thích hợp thì đa số các protein trong dung dịch máu cá sẽ bị kết tủa và lắng xuống. Tuy nhiên, nếu để lắng tự nhiên thì quá trình lắng rất chậm và mất nhiều thời gian, khơng đảm bảo yêu cầu xử lí cơng nghiệp. Do đĩ cần
Dịch thải máu cá Tra
Điều chỉnh về các mức nhiệt độ 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75oC
Xác định hiệu suất thu hồi
bổ sung chất trợ lắng để để tăng nhanh quá trình lắng và thu hồi protein. Ở đây, chúng ta sử dụng dung dịch CaCl2 ở các nồng độ khác nhau để khảo sát hiệu quả trợ lắng và hiệu suất thu hồi protein.
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm thăm dị để xác định nồng độ CaCl2thích hợp nhằm tăng hiệu quả thu hồi protein trong dung dịch máu cá sau nâng nhiệt
Thí nghiệm được tiến hành như sau: lấy 600 ml dịch thải máu cá chứa vào cốc thủy tinh dung tích 1 lít, sau đĩ xử lí ở nhiệt độ thích hợp đã xác định trong thí nghiệm 1 trong thời gian 5 phút, khơng kể thời gian nâng nhiệt. Sau đĩ khuấy đều rồi chia dịch máu cá vào 5 cốc thủy tinh dung tích 250ml, mỗi cốc chứa 100 ml dịch máu cá đã nâng nhiệt. Lấy 1 cốc làm mẫu đối chứng. Lần lượt bổ sung CaCl2 ở các nồng độ 5ppm, 10 ppm, 15ppm, 20ppm vào các cốc cịn lại. Quan sát hiên tượng, sau đĩ lọc lấy dịch và xác định hàm lượng protein cịn lại theo phương pháp Microbiuret.
Dịch thải máu cá Tra đã nâng nhiệt ở nhiệt độ thích hợp được xác định ở thí nghiệm trên
Bổ sung CaCl2 để trợ lắng ở các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20 (ppm)
Xác định hiệu suất thu hồi Chọn nồng độ CaCl2 bổ sung
II.2.2.2. Bố trí thí nghiệm thăm dị để xác định nồng độ chitosan thích hợp nhằm tăng hiệu quả thu hồi protein trong dung dịch máu cá sau khi nâng nhiệt và bổ sung CaCl2 trợ lắng
Sau khi bổ sung CaCl2 làm chất trợ lắng, kết tủa protein lắng rất nhanh, tuy nhiên lại tạo thành hạt mịn, dễ phân tán trở lại dung dịch gây khĩ khăn cho việc thu hồi. Vì vậy, việc bổ sung chitosan vừa cĩ tác dụng là thêm chất keo tụ (coagulant), mặt khác chitosan cũng là chất tạo bơng (flocculant), làm cho kết tủa protein lắng nhanh hơn và hạt kết tủa protein lớn hơn. Do đĩ, việc thu hồi protein bằng cách lắng lọc sẽ dễ dàng hơn.
Dung dịch chitosan được chuẩn bị như sau: cân 0.27g chitosan ( độ deacetyl 85%, phân tử lượng 1,1 triệu Dalton) hịa tan vào 25ml acid acetic 1% sẽ thu được 25ml dung dịch chitosan 1% (10.000ppm).
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm thăm dị nồng độ chitosan thích hợp nhằm tăng hiệu quả thu hồi protein trong dung dịch máu cá sau khi nâng nhiệt và bổ sung CaCl2
Dịch thải máu cá Tra đã nâng nhiệt và bổ sung CaCl2ở nồng độ thích hợp đã được tiến
hành ở các thí nghiệm trên
Bổ sung chitosan để trợ lắng và tạo bơng ở các nồng độ
0, 25, 50, 75, 100, 125 (ppm) Xác định hiệu suất thu hồi Chọn nồng độ chitosan bổ
Thí nghiệm được tiến hành như sau: lấy 700 ml dịch thải máu cá chứa vào cốc thủy tinh dung tích 1 lít, sau đĩ xử lí ở nhiệt độ thích hợp đã xác định trong thí nghiệm 1 trong thời gian 5 phút, khơng kể thời gian nâng nhiệt. Bổ sung CaCl2 ở nồng độ đã xác định là thích hợp ở thí nghiệm 2. Sau đĩ chia dịch máu cá đã xử lí vào 6 cốc thủy tinh dung tích 250ml, mỗi cốc 100ml dịch. Lấy 1 cốc làm mẫu đối chứng. Sau đĩ bổ sung dung dịch chitosan ở các nồng độ 25ppm, 50ppm, 75ppm, 100ppm, 125ppm vào các cốc cịn lại. Quan sát hiên tượng, sau đĩ lọc lấy dịch và xác định hàm lượng protein cịn lại theo phương pháp Microbiuret.
II.1.4. Phương pháp phân tích
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Microbiuret (phụ lục trang , cĩ sử dụng phương pháp Kejldahl để kiểm chứng độ chính xác. Thành phần acid amin được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
- Hiệu suất thu hồi protein được tính theo cơng thức sau: HS(%) = *100
C Ca C
Trong đĩ:
HS (%) : Hiệu suất thu hồi protein (%)
C : Hàm lượng protein trong dịch thải máu cá ban đầu Ca : Hàm lượng protein trong dịch lọc sau khi xử lí
- Phương pháp xử lí số liệu:
Số liệu kết quả thí nghiệm được xử lí bằng phần mềm Excel, kết quả cuối cùng là trung bình của 3 lần phân tích.
II.1.3. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ - Cốc thủy tinh 250 ml, 500ml, 1000ml - Bình tam giác 125ml, 250ml - Ống đong 100ml - Giấy lọc Watman Máy mĩc, Thiết bị
- Máy đo pH - meter Fisher - Máy ổn nhiệt
- Máy li tâm
- Máy UV-vis mini
- Thiết bị chưng cất đạm tổng quát bán tự động - Tủ lạnh
- Tủ sấy
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1. Kết quả khảo sát nguyên liệu máu cá
Dịch thải máu cá Tra sau cơng đoạn cắt tiết, tùy vào tỉ lệ pha lỗng và điều kiện xử lí của từng nhà máy sẽ cĩ biến động rất lớn về thành phần protein, acid amin cũng như BOD5, COD, SS. . .Kết quả phân tích về các chỉ tiêu hĩa lí ban đầu của dung dịch máu cá tại nhà máy chế biến cá Tra Thái Bình Dương thuộc cơng ty cổ phần Nam Việt như sau:
Bảng 3.1. Các đặc trưng hĩa lí của nguyên liệu
Stt Đặc trưng hĩa lí Giá trị
1 pH 6,9 – 7,4
2 Tro tổng số (%) 0,645 3 Nitơ tổng số (gN/l dịch thải máu cá) 3,863 4 Protein tổng số (gPr/l dịch thải máu cá) 25,27 5 BOD5 (mg/l) 1320 6 COD (mg/l) 2509 7 TSS (mg/l) 1960 8 Acid amin (mg/kg) 915,37
Nhìn vào bảng 3.1 ta thấy dung dịch máu cá ban đầu chứa hàm lượng protein khá cao, đạt 25,27 gPr/lit, tuy nhiên các chỉ số về mơi trường lại vượt quá tiêu chuẩn cho phép. So sánh các chỉ tiêu của dung dịch máu cá với tiêu chuẩn nước thải loại B 5945 – 1995 (Bảng 3.7 phụ lục) ta thấy: chỉ số BOD5 của dung dịch máu cá cao gấp 26,4 lần, COD cao gấp 25,09 lần, TSS cao gấp 19,60 lần so với tiêu chuẩn cho phép.
Khi so sánh các chỉ tiêu này của dịch thải máu cá với nước rửa surimi trong Bảng 3.2 ta thấy:
Bảng 3.2. Các chỉ tiêu hĩa lí của nước rửa surimi [6]
- pH của dịch thải máu cá cao hơn so với nước rửa surimi.
- Hàm lượng chất rắn lơ lửng (SS) trong dung dịch máu cá thấp hơn so với nước rửa surimi, tuy nhiên hàm lượng protein hịa tan của dung dịch máu cá lại cao hơn gấp 5 lần. Vì vậy, việc nghiên cứu thu hồi protein từ dịch thải máu cá sẽ thu được lượng protein lớn hơn, do đĩ khả thi hơn khi áp dụng vào thực tế. Do đĩ, nếu dịch thải máu cá khơng được xử lí mà thải trực tiếp ra mơi trường thì khơng chỉ là một mối nguy ơ nhiễm lớn mà cịn là sự lãng phí một nguồn protein cĩ giá trị. Bởi vì protein của dung dịch máu cá cĩ chứa nhiều loại acid amin cần thiết cho sự phát triển của cơ thể động vật. Kết quả phân tích thành phần acid amin trong dung dịch máu cá Tra được thể hiện trong bảng 3.2
Từ bảng kết quả phân tích 3.3 ta thấy protein trong dịch thải máu cá cĩ chứa nhiều acid amin khơng thay thế. Trong khi đĩ hàng ngày các nhà máy chế biến cá Tra fillet đơng lạnh thải ra một lượng dung dịch máu cá rất lớn. Hầu hết lượng máu cá thải này bị thải trực tiếp ra mơi trường hoặc đưa vào các bể xử lí nước thải và khơng cĩ cơng đoạn thu hồi protein nào đáng kể. Đây là một sự lãng phí rất lớn nguồn protein hịa tan cĩ giá trị. Vì vậy, việc thu hồi protein trong dịch thải máu cá là việc làm hết sức cần thiết, vừa để giải quyết vấn đề mơi trường, lại giúp tăng hiệu quả kinh tế.
Bảng 3.3. Thành phần acid amin trong dung dịch máu cá
Stt Tên acid amin Hàm lượng (mg/kg) 1 Alanine 17,40 2 Glycine 4,80 3 Valine 35,65 4 Leucine 12,10 5 Isoleucine 27,14 6 Threonine 1,09 7 Serine 8,67 8 Proline 39,79 9 Asparagine 25,41 10 Methionine sulfoxide 23,12 11 4 – Hydroxyproline 363,29 12 Glutamine 0,86 13 Phenylalanine 93,29 14 Lysine 19,27 15 Histidine 76,64 16 Hly 47,52 17 Tyrosin 118,89 Tổng acid amin 915,37
III.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi protein.
Trong số các yếu tố gây kết tủa protein thì nhiệt độ là tác nhân phổ biến nhất. Để thu nhận protein bổ sung dinh dưỡng, người ta thường bắt đầu bằng gây biến tính nhiệt protein.
Tiến hành nâng nhiệt các mẫu dịch thải máu cá lên nhiệt độ 40oC, 50oC, 55oC, 60
oC, 62oC, 65oC, 67oC, 70oC, 75oC, thời gian xử lí là 5 phút. Lọc lấy dịch, phân tích hàm lượng protein cịn lại trong dịch lọc. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2 và bảng phụ lục 3.1. 8.48 27.25 64.57 85.56 83.85 86.71 78.86 55.44 0 20 40 60 80 100 40 50 55 60 62 65 67 70 75 Nhiệt độ (oC) H iệ u su ất (% )
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi protein
Qua bảng số liệu (phụ lục 3.1) và hình 3.2, chúng ta thấy nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu hồi protein. Theo đĩ, sự biến thiên của hiệu suất theo nhiệt độ như sau:
Khi tăng nhiệt độ từ 40oC - 65oC, thời gian xử lí là 5 phút, nhiệt độ càng tăng thì hiệu suất kết tủa protein càng cao.
Tuy nhiên, trong khoảng nhiệt độ 65oC - 75oC, hiệu suất thu hồi protein lại tăng khơng nhiều. Thật vậy, ở nhiệt độ 65oC thì hiệu suất thu hồi là 78,86%, so với tại 75oC cĩ hiệu suất thu hồi là 86,71% thì chênh lệch khơng lớn.(nếu so với sự tăng nhiệt độ).
Đối với phần dịch, ở các giá trị nhiệt độ 55, 60oC thì vẫn cịn màu sẫm, tuy nhiên khi tăng nhiệt độ lên thì màu mất dần và ở 62oC trở đi, màu của dung dịch sau kết tủa hầu như khơng cịn.
Ở nhiệt độ 62oC trở lên cho hiệu suất thu hồi là cao nhất (trên 60%). Điều này cĩ thể giải thích như sau:
Khi đun nĩng sẽ làm phá lớp vỏ điện tích và làm giảm khả năng hidrad hĩa của phân tử protein. Khi nhiệt độ tăng, chuyển động nội tại của các phân tử protein tăng làm phá vỡ các liên kết hydrogen giữa các phân tử protein, do đĩ khả năng hấp thụ nước của protein bị giảm. Ngồi ra khi đung nĩng sẽ gây biến tính và tập hợp protein làm cho bề mặt của phân tử protein bị giảm, do đĩ khả năng giữ nước của các nhĩm cĩ cực ở protein cũng giảm theo. Như vậy, nếu căn cứ vào đồ thị 3.2, ngưỡng nhiệt độ phá vỡ lớp vỏ hidrad, hĩa làm mất khả năng giữ của phân tử protein là 60oC
Hình 3.2 cho thấy: từ 40oC đến dưới 62oC thì hiệu suất thu hồi protein thấp, chứng tỏ lượng protein trong dịch thải máu cá kết tủa ít. Từ 62 oC trở lên thì hiệu suất thu hồi protein tăng lên đáng kể.
Ở khoảng nhiệt độ từ 62oC đến 67 oC (tăng 5oC) thì hiệu suất thu hồi protein tăng nhanh, từ 64,57% tăng lên 83,85% (tăng 19,28%). Trong khi đĩ từ 67 oC đến 75oC thì hiệu suất lại tăng chậm (từ 83,85% đến 86,71%). Nếu xét đến chi phí về kinh tế cho quá trình nâng nhiệt thì rõ ràng khoảng nhiệt độ từ 62 oC đến 67oC là ít tốn kém hơn. Do vậy, chúng ta cĩ thể kết luận rằng khoảng nhiệt độ thích hợp nhất áp dụng để nâng nhiệt thu hồi protein trong dịch thải máu cá là 62oC – 67oC. Để đảm bảo tính trung bình giữa hai điểm mút này, ta chọn nhiệt độ 65 oC là nhiệt độ thích hợp nhất để kết tủa