thuật điện di hai chiều
3.4.3.1 So sánh mức độ biểu hiện protein ở giống đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt Chúng tôi sử dụng lá của 2 giống đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12
và VMK) để nghiên cứu. Mẫu đối chứng là mẫu lá không bị lây nhiễm còn mẫu thí nghiệm là mẫu lá đã lây nhiễm và thấy có hiện tượng nhiễm bệnh. Tiến hành so sánh mức độ biểu hiện của các protein lá của 2 giống này chúng tôi thu được kết quả như sau:
Trong nghiên cứu này, protein lá của mẫu đối chứng và thí nghiệm ở cùng thời điểm 9 ngày sau khi lây bệnh được phân tách bằng 2-DE, sau đó gel được nhuộm bằng coomassie G250 (Hình 3.12). Kết quả cho thấy các điểm protein phân bố chủ yếu ở vùng pH từ 5 đến 9, nhiều điểm protein tạo thành vệt có cùng một khối lượng nhưng điện tích khác nhau (các dạng tương đồng). Điều này là do cùng một protein nhưng chúng có trạng thái điện tích khác nhau nên có các đồng phân khác nhau.
Hình 3.12. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương đối chứng và thí nghiệm của 2 giống sau gây nhiễm bệnh 9 ngày (DT12 và VMK)
Ở cả hai giống DT12 và VMK, mẫu thí nghiệm có 9 điểm protein cùng biểu thị mức độ thay đổi (tăng/giảm1,5 lần), trong đó 8 điểm (điểm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9) có nồng độ tăng và một điểm (điểm số 8) có mức độ biểu hiện giảm khi so với đối chứng (Hình 3.12 và Bảng 3.7). Đáng chú ý, ngoài bốn điểm (2, 6, 8 và 9) có hàm lượng protein lớn thì 5 điểm còn lại (1, 3, 4, 5, 7) đều có hàm lượng protein khá thấp.
Bảng 3.7. Đa dạng mức độ biểu hiện của các protein giữa mẫu thí nghiệm và đối chứng của hai giống nhiễm bệnh (DT12 và VMK)
Kích thước Tăng/giảm Tăng Tăng Tăng Tăng Tăng Tăng Tăng Giảm Tăng phân tử ước tính (kDa) ~7,0 19,5 18,0 21,0 22,0 26,0 25,0 39,5 51,0
Trong lá đậu tương, các protein chiếm hàm lượng lớn chủ yếu là các protein tham gia vào quá trình quang hợp (Rubisco và các protein của hệ
thống quang hóa) hoặc protein dự trữ ở lá. Việc tăng (hoặc giảm, thậm chí mất hẳn) nồng độ của một số protein ở mẫu thí nghiệm so với đối chứng của các lá bị nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) chứng tỏ ở các giống này đã có sự biến đổi về mức độ trao đổi chất, sự thay đổi hoạt động của các gen dẫn đến hàm lượng của một số protein thay đổi khi có quá trình nhiễm bệnh xảy ra. Có thể sự biến đổi về hàm lượng của các protein này có liên quan đến quá trình nhiễm bệnh hoặc các phản ứng sinh lý của cây do hậu quả của việc nhiễm bệnh. Bằng phương pháp sắc ký khối phổ ESI-Q-TRAP, các điểm protein khác biệt này đã được nhận diện ở bảng 3.8
Bảng 3.8. Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện khác nhau giữa thí nghiệm và đối chứng ở hai giống nhiễm bệnh DT12 và VMK
T T
Tên protein Spot Số đăng ký Điểm số Khối lượng Chức năng kDa Tăng/ Giảm
1 PSI PsaN subunit precursor 2 PSI reaction centre subunit
IV A 1 2 gi|5902586 gi|5606709 212 179 15.4 16.3 Quang hợp Quang hợp Tăng Tăng 3 Chưa định danh được 3, 4, 5 Tăng
4 Stem 28 kDa protein 5 Vegetative storage protein
6 7 gi|169898 gi|170088 128 122 29.0 32. Dự trữ Dự trữ Tăng Tăng 6 Ribose 5- phosphate isomerase
8 gi|15285625 89 20.1 Trao đổi chất
Tăng Tạo nặng lượng, tham 7 Rubisco large subunit
9 gi|3114769 235 54.2 gia trong quá
Giảm trình cố định
Kết quả nhận diện cho thấy, giữa mẫu đối chứng và mẫu nhiễm bệnh của hai giống DT12 và VNK, các protein được phát hiện là các protein có liên quan đến chu trình quang hợp (PSI PsaN subunit precursor, PSI reaction centre subunit IV A, rubisco large subunit), các protein dự trữ (stem 28 kDa protein, vegetative storage protein) hoặc protein liên quan đến trao đổi chất (ribose 5-phosphate isomerase). Đặc biệt ở các điểm 3,4,5 không nhận diện được trên cơ sở dữ liệu protein.
Hiện nay đã có một số nghiên cứu về protein lá đậu tương [14], [86], [113], tuy nhiên các kết quả so sánh các protein lá nhiễm bệnh với lá chưa lây nhiễm hầu như còn hạn chế. Do vậy, theo hiểu biết của chúng tôi, việc các protein quang hợp và các protein dự trữ trong lá tăng, chứng tỏ chúng hoạt động mạnh tại thời điểm 9 ngày sau lây nhiễm, trong khi đó protein liên quan đến trao đổi chất lại giảm. Như chúng ta đã biết, khi bị nhiễm nấm thì cây đậu sẽ trưởng thành sớm và hậu quả là quá trình quang hợp giảm, lá bị đốm vàng, rụng và năng suất hạt kém. Tuy nhiên, trong giai đoạn 9 ngày lây nhiễm, theo hiểu biết của chúng tôi, rất có thể cây có những thay đổi về sinh lý, hóa sinh như quá trình quang hợp lại diễn ra mạnh, protein dự trữ được tổng hợp tăng cường trong một thời gian nhất định để cây trưởng thành sớm. Bằng chứng là nồng độ các protein tham gia vào quá trình quang hợp như PSI PsaN subunit precursor, PSI reaction centre subunit IV A, rubisco large subunit và các protein dự trữ như stem 28 kDa protein, vegetative storage protein tăng. Hiện nay, chưa thấy có nghiên cứu nào ghi nhận sự biến đổi của nồng độ các protein lá ở giai đoạn 9 ngày lây nhiễm. Do đó, các nghiên cứu của chúng tôi đã cung cấp những dẫn liệu ban đầu đồng thời gợi ý hướng nghiên cứu về hệ protein lá để có thể tiếp cận gần hơn với cơ chế bệnh, ngoài hướng nghiên cứu về gen.
Đây là các thông tin ban đầu và rất hữu ích cho việc nghiên cứu bệnh gỉ sắt ở mức độ protein. Vì vậy, cần có những nghiên cứu tiếp theo để khẳng định tác động của bệnh gỉ sắt đến cơ chế trao đổi chất của cây đậu tương nhiễm bệnh.
3.4.3.2. So sánh mức độ biểu hiện protein giữa giống đậu tương nhiễm bệnh và kháng bệnh gỉ sắt
Nhằm tìm hiểu những thay đổi của các protein giữa một số giống đậu tương nhiễm bệnh và kháng bệnh, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành phân tích 02 giống nhiễm (DT12 và VMK) và 02 giống kháng (DT2000 và CBU8325). Kết quả cho thấy, có 06 điểm protein lá ở giống nhiễm có hàm lượng tăng so với giống kháng (Hình 3.13).
CBU8325
Hình 3.13. So sánh sự đa dạng protein lá đậu tương sau gây nhiễm 9 ngày của 2 giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và 2 giống kháng bệnh gỉ sắt
Toàn bộ 6 điểm protein có mức độ biểu hiện tăng ở giống nhiễm (DT12 và VMK) so với giống kháng (DT2000 và CBU8325) cho thấy trong quá trình nhiễm bệnh, đã có sự thay đổi về quá trình trao đổi chất và chuyển hóa của các protein trong lá, tuy nhiên sự tổng hợp các protein trong giống kháng dường như không thay đổi. Kết quả ở bảng 3.9 thể hiện mức độ so sánh tăng/giảm của các điểm protein được so sánh.
Bảng 3.9. Mức độ protein biểu hiện khác nhau giữa giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) và giống kháng (DT2000, CBU8325)
DT12
Bằng phương pháp phân tích khối phổ, chúng tôi đã tiến hành nhận điện các điểm protein này, kết quả như ở bảng 3.9. Phân tích cho thấy, ở các giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12 và VMK) trong 6 điểm đem phân tích thì có 4 protein đã được nhận dạng và có mức độ biểu hiện tăng là Rubisco large subunit , Rubisco small subunit rbcS2, PSI reaction centre subunit IV A, Glyceraldehyde-3-phosphate. Đặc biệt có hai điểm 3 và 4 không nhận diện được protein. Có thể đây là những protein chưa được đăng ký trên cơ sở dữ liệu protein nên chưa phát hiện được.
Bảng 3.10. Nhận diện các protein có mức độ thay đổi giữa giống nhiễm và giống kháng bệnh gỉ sắt
TT Tên protein Spot Số đăng ký
Điểm số Khối lượng kDa Chức năng Tăng/ Giảm Tạo nặng 1 Rubisco small subunit
rbcS2
1 gi|10946377 169 20.2 lượng, tham gia trong quá trình
Tăng
cố định carbon 2
PSI reaction centre subunit IV A
2 gi|5606709 179 16.3 Quang hợp Tăng
3 C h ư a đ ị n h d a n h đ ư ợ c Gly cer ald ehy de- 3- 3, 4
ate dehydr ogenas e A subunit phân Tạo nặng 5 Rubisco large subunit
6 gi|3114769 348 53.2 lượng, tham
gia trong quá trình
Tăng
cố định carbon
Qua quá trình nghiên cứu sự đa hình mức độ biểu hiện protein giữa các giống nhiễm và đối chứng, giữa giống nhiễm và giống kháng, chúng tôi đã bước đầu ghi nhận sự thay đổi về hàm lượng protein trong quá trình bị nhiễm hoặc kháng bệnh. Điều thú vị là ở giống nhiễm, mức độ biểu hiện của một số
protein (protein tham gia vào quá trình quang hợp và dự trữ) đều có hiện tượng tăng cao hơn so với khi chưa lây nhiễm hoặc so với giống kháng. Điều này đã chứng tỏ, sự lây nhiễm bệnh gỉ nấm đã ảnh hưởng đến quá trình sinh hóa trong cây, làm tăng mức độ hoạt động của một số gen kiểm soát các protein quang hợp và protein dự trữ như bảng 3.9 và bảng 3.10. Hay nói cách khác, mức độ biểu hiện protein lá của giống kháng bệnh và lá khi chưa bị lây nhiễm là khá giống nhau. Theo hiểu biết của chúng tôi, điều này khá hợp lý, vì khi đã kháng bệnh, cây ít chịu ảnh hưởng tác động của bệnh cho nên các quá trình sinh trưởng và phát triển của cây diễn ra khá bình thường như là ở giống chưa bị nhiễm bệnh, cho nên hàm lượng các protein không bị ảnh hưởng rõ rệt, khác với khi cây bị nhiễm bệnh. Đây mới là những số liệu cơ sở ban đầu, là tiền đề để phân tích, tìm hiểu sâu hơn vai trò của chúng trong quá trình kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương.
Sự kết hợp nghiên cứu đa dạng di truyền DNA và đa dạng protein ngày càng trở nên cấp thiết. Sự đa dạng nguồn gen đảm bảo cho việc tồn tại những gen chủ chốt trong tập đoàn và khả năng tìm kiếm có hiệu quả. Trên thức tế, có nhiều gen tồn tại trong hệ gen nhưng không được kích hoạt để biểu hiện, hoặc biểu hiện ở mức độ rất yếu. Các tính trạng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi cũng như tính kháng bệnh ở cây trồng phụ thuộc vào sự kích hoạt biểu hiện những gen đóng vai trò chủ chốt trong quá trình này. Hệ protein tổng thể trong từng trường hợp là bức tranh hoàn hảo để đánh giá khả năng biểu hiện của các gen chống chịu cũng như kháng bệnh. Tuy nhiên, đây là phương pháp với những kỹ thuật hiện đại, mà trong đó vai trò quyết định bao gồm nhiều khâu chuẩn bị: chọn giống kháng và giống mẫn cảm với bệnh đặc hiệu, tìm được thời điểm thích hợp để nhiễm bệnh, thu mẫu sau khi nhiễm. Quy trình tách chiết mẫu ban đầu đòi hỏi phải có sự nghiên cứu dày công tiếp theo. Kết quả bước đầu của chúng tôi mở ra hướng nghiên cứu về proteomics có hiệu quả đối với đặc tính chống chịu bệnh và stress của cây đậu tương nói riêng và thực vật nói chung.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Đã phân loại được phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt của 50 giống đậu tương nghiên cứu thành 3 nhóm chính: 13 giống thuộc nhóm kháng bệnh, 25 giống thuộc nhóm nhiễm bệnh, 12 giống thuộc nhóm trung gian. So với lý lịch về tính kháng bệnh của các giống, đã phát hiện ra được 6 giống kháng mới là PMTQ, HSP1, HSP2, CNB, ZG và MTD65.
1.2. Các thành phần protein và lipid của 50 giống đậu tương và thành phần các amino acid của 20 giống chọn lọc đã được phân tích. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về thành phần hóa sinh giữa 3 nhóm kháng bệnh, trung gian hay nhiễm bệnh gỉ sắt.
1.3. Nghiên cứu đa hình DNA của các giống đậu tương cho thấy sử dụng chỉ thị SSR ưu việt và có độ tin cậy cao hơn so với kỹ thuật RAPD thông qua độ đa hình của mồi cao hơn (93% so với 75%), hệ số sai khác di truyền lớn hơn (29% so với 21%) và sự phân nhóm rõ ràng hơn (5 nhánh lớn so với 2 nhánh). Bước đầu đã có sự phân nhóm theo khả năng kháng bệnh gỉ sắt khi sử dụng kỹ thuật SSR, tuy nhiên ở kỹ thuật RAPD sự phân nhóm là khá ngẫu nhiên, chưa theo khả năng kháng bệnh.
1.4. Đã thiết lập được bản đồ điện di 2-DE của protein lá đậu tương ở giống DT2000 với 119 điểm protein trên gel, trong đó có 35 protein đã được định danh và phân loại theo 9 nhóm chức năng. Đặc biệt, có 3 protein liên quan đến khả năng kháng bệnh/phòng vệ, chống stress, chịu hạn đã được phát hiện.
1.5. So sánh mức độ biểu hiện protein của hai giống đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) có 8 điểm protein tăng và 1 điểm protein giảm so với đối chứng, đã nhận diện và định danh được 6/9 điểm protein. Trong khi đó, ở hai giống nhiễm bệnh gỉ sắt (DT12, VMK) có 6 điểm protein tăng so với hai giống kháng bệnh gỉ sắt (DT2000, CBU8325), đã nhận diện và định danh được 4/6 điểm protein.
2. Đề nghị
2.1. Có thể sử dụng những giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt giới thiệu cho sản xuất hoặc làm nguyên liệu trong lai tạo giống.
2.2. Có thể sử dụng thông tin về sự đa dạng di truyền ở mức DNA làm cơ sở cho việc lai tạo giống, tuy nhiên cần mở rộng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật SSR với số lượng mồi và giống nghiên cứu nhiều hơn.
2.3. Hướng nghiên cứu ở mức độ protein của các giống kháng bệnh gỉ sắt là cách tiếp cận hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc phát hiện cơ chế kháng bệnh. Do đó, cần tiếp tục tìm hiểu, nghiên cứu sâu hơn về vai trò và chức năng của các protein thay đổi ở các giống đậu tương nhằm tìm hiểu cơ chế nhiễm bệnh, cũng như tính kháng bệnh gỉ sắt của cây đậu tương.
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. TA Pham, CB Hill, MR Miles, BT Nguyen, TT Vu, TD Vuong, TT VanToai, HT Nguyen, GL Hartman. “Evaluation of soybean for resistance to soybean rust in Vietnam”. Elsevier - Field Crops Research 117: 131-138.
2. Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên, Chu Hoàng Mậu. “Đánh giá sự đa dạng di truyền của 50 giống đậu tương Việt Nam có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt bằng chỉ thị SSR”. Tạp chí Sinh học, 34(2), tr. 235-240. 3. Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên, Chu Hoàng Mậu. “Nghiên cứu mối
quan hệ di truyền của một số giống đậu tương Việt Nam có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 85(9)/2, tr. 11-16.
4. Vũ Thanh Trà, Hà Hồng Hạnh, Trần Thị Phương Liên, Chu Hoàng Mậu. “Phân lập và phân tích protein từ lá cây đậu tương”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 85(01)/1: 303-310.
5. Vũ Thanh Trà, Hà Hồng Hạnh, Trần Thị Phương Liên, Chu Hoàng Mậu.
“Phân tích protein của lá đậu tương nhiễm bệnh gỉ sắt bằng phương pháp điện di hai chiều”. (Bài gửi Tạp chí Công nghệ sinh học - chờ đăng).
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Phạm Văn Biên (1985), Một số kết quả nghiên cứu sâu bệnh hại đậu nành, Nxb Khoa học và Kỹ thuật nông nghiệp.
2. Nguyễn Thị Bình (1990), Nghiên cứu và đánh giá khả năng chống chịu bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhisi sydow) của tập đoàn đậu tương Miền Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Hà Nội.
3. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội.
4. Vũ Anh Đào, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2011), "Đánh giá sự di truyền ở mức phân tử của một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương", Tạp chí Khoa học và Công nghệ 57(9): 85-90. 5. Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn và Nguyễn Văn
Được (2004), "Nghiên cứu đa dạng sinh học của giống cây có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang", Tạp chí Khoa học (1): 105-114. 6. Hinson K (1992), Sản xuất đậu tương ở vùng nhiệt đới, Nxb Đại học
Giáo dục chuyên nghiệp, Hà Nội.
7. Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu và đánh giá khả năng chịu hạn của các mẫu giống đậu tương nhập nội ở miền Bắc Việt Nam. Luận án Phó tiến sĩ, Hà Nội.
8. Nguyễn Đăng Khôi (1997), "Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam", Tạp chí