phân tử SSR
Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) - một chỉ thị đồng trội biểu thị tính đa hình cao được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền, nghiên cứu quá trình tiến hóa, làm rõ độ thuần của vật liệu tạo giống... Chỉ thị SSR được phát triển mạnh và có ưu thế trong nghiên cứu về tính đa dạng di truyền, lập bản đồ gen ở đậu tương [12], [18], [24], [26].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 15 cặp mồi SSR (Bảng 2.3) trong phản ứng PCR-SSR để nhân bản các phân đoạn DNA từ hệ gen của 50 giống đậu tương, kết quả phân tích hình ảnh điện di sản phẩm SSR của 15 cặp mồi (hình 3.5A, hình 3.5B, hình 3.5C và hình 3.5D). Sản phầm PCR-SSR được kiểm tra trên gel agarose 1,5%. Sau đó, các phân đoạn PCR-SSR được phân tách trên điện di polyacrylamide 15% và nhuộm bạc. Trong số 15 chỉ thị SSR sử dụng để phân tích sự đa dạng di truyền của 50 giống đậu tương thì có 14 chỉ thị cho tính đa hình di truyền (trừ chỉ thị Satt460 có kết quả không đa hình).
Thống kê các phân đoạn DNA được nhân bản, chúng tôi đã phát hiện được 81 alen tại 14 locus, số alen đa hình tại mỗi locus biến động từ 4 đến 8 và đạt trung bình là 6 alen (bảng 3.5). Chỉ thị Satt489 cho số lượng alen nhiều nhất là 8 alen. Giá trị PIC (Hàm lượng thông tin đa hình) của các chỉ thị SSR biến động từ 0,473 đến 0,798, đạt trung bình 0,729 và biên độ dao động của hệ số đa dạng giữa các chỉ thị là tương đối hẹp (0,473 - 0,798) (bảng 3.5). Kết quả này cho tính đa hình cao hơn khi so sánh với nghiên cứu của Trần Thị Ph- ương Liên và cộng sự trên cùng đối tượng (0,6326) [13]. So sánh với một số tác giả khác trên thế giới, kết quả phân tích đa hình di truyền DNA trên các giống đậu tương của chúng tôi tiệm cận với nghiên cứu của Abe và cộng sự (2003) trên tập đoàn 131 giống đậu tương từ 14 nước Châu Á (hệ số đa dạng trung bình 0,782), cao hơn so với nghiên cứu của Narvel và cộng sự (2000) trên 74 giống đậu tương ở Bắc Mỹ (hệ số đa dạng trung bình 0,56) [85].
A
B
C
D
Hình 3.5. Các alen tại locus Satt009 (A), Satt175 (B), Satt146 (C) Satt 005 (D) của 50 giống đậu tương
Trong 15 cặp mồi SSR, có 7 cặp mồi thường được sử dụng để nghiên cứu đa dang di truyền là Satt-042, Satt-005, Satt-146, Satt-173, Satt-175, Satt-009 và Satt-431, chúng thường cho nhiều allen: từ 7-11 allen [26], [85]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các chỉ thị này cho số allen dao động từ 4-7 alen. Mức đa hình tương ứng với độ biến động di truyền giữa các mẫu giống đậu tương đã chứng tỏ sự đa dạng di truyền tồn tại ở các giống đậu tương, nhưng không quá lớn. Hệ số tương đồng cao nhất được
phát hiện giữa giống đậu tương SL và HG1 là 0,97. Mối quan hệ này được hỗ trợ bằng sơ đồ hình cây qua kết quả phân tích nhóm (Hình 3.6).
Giá trị tương đồng cao chứng tỏ sự tồn tại dòng chung chuyển gen và trao đổi gen và mức độ chọn lọc ở đậu tương khá cao. Hệ số tương đồng thấp nhất (0,68) được xác định giữa các giống nhiễm bệnh gỉ sắt đối với các giống có phản ứng trung gian và kháng bệnh gỉ sắt. Tuy nhiên, trên cùng một nhóm nhiễm bệnh gỉ sắt được biểu hiện trên biểu đồ hình cây, giống VK2 có phản ứng trung gian với bệnh gỉ sắt nhưng lại có xu hướng nghiêng về nhóm nhiễm bệnh gỉ sắt.
Bảng 3.5. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
STT SSR Dạng SSR Liên kết Số alen PIC 1 Satt005 (ATT)19 D1b 7 0,770 2 Satt009 (ATT)14 N 5 0,690 3 Satt042 (ATT)27 A1 4
Phân tích sơ đồ hình cây ở hình 3.6 cho thấy 50 giống đậu tương nghiên cứu được chia thành hai nhánh rõ rệt, khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 29% (1-0,71):
(1) Nhánh thứ nhất, bao gồm các giống nhiễm bệnh gỉ sắt và một giống trung gian VK2, có thể phân tiếp thành hai nhánh phụ. Nhánh phụ thứ nhất (nhóm I) gồm 9 giống DBBT, CV, CSGL, DL, HG, QHCB, HG1, SL và VX93 có khoảng cách di truyền gần nhau, với hệ số tương đồng dao động từ 0,802 đến 0,975. Nhánh phụ thứ hai lại chia ra hai nhánh nhỏ bao gồm: (i) nhánh nhỏ 1
có các giống (nhóm II) như HTDT, MH, DTBT, VMK, LVG, HN, CBD, ND, V79, DT84, DT12, và (ii) nhánh nhỏ 2 có các giống (nhóm III): MD, MT2, CB7, VX92, TTHT và VK2, có hệ số tương đồng từ 0,65 đến 0,95.
(2) Nhánh thứ hai bao gồm các giống kháng bệnh và các giống trung gian. Trong nhánh này, cũng có 2 nhánh phụ: nhánh phụ thứ nhất gồm các giống (nhóm IV) như DT96, CT2, HG2, VK3, MT1, CT1, PS, NS, M103, PT và PHCB với hệ số tương đồng từ 0,75 - 0,95; trong khi đó nhánh phụ thứ hai
lại phân chia làm 2 nhánh phụ nhỏ. Nhánh phụ nhỏ 1 có các giống (nhóm V) như CBU8325, ZG, CNB, HSP1, PI462312 với hệ sống tương đồng từ 0.82- 0,95, nhánh phụ nhỏ 2 có các giống (nhóm VI) như MTD65, DT2000, HSP2, PI230970, PI459025, PMTQ, DT95, PI200492 với khoảng cách di truyền trong khoảng 0,68-0,95.
Sự phân nhánh chi tiết trên sơ đồ hình cây cho thấy các giống đậu tương nghiên cứu có sự tương đồng cao với các giống kháng bệnh chuẩn như: các giống DT95 và PMTQ với các giống PI200492 (Rpp1), PI459025 (Rpp4); các giống HSP2, DT2000, MTD65 với giống PI230970 (Rpp2), các giống HSP1, CNB, ZG, CBU8325 với giống PI462312 (Rpp3). Các giống kể trên có chứa các gen kháng tương ứng hay không là vấn đề rất lý thú và cần được tiếp tục nghiên cứu.
VI Nhánh phụ II Nhánh thứ hai Nhánh phụ I V IV III Nhánh phụ II II Nhánh thứ nhất Nhánh phụ I I
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ của 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt dựa trên chỉ thị phân tử SSR
Một số công trình nghiên cứu lập bản đồ QTL liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt ở các giống đậu tương của Mỹ, Brazil đã phát hiện thấy một số chỉ thị SSR liên kết gần với gen quy định tính trạng kháng bệnh gỉ sắt trên nhiễm sắc thể: Sat-064, Sct-187 liên kết với Rpp1 trong nhóm liên kết G trên NST số 18; Sat-460 liên kết với Rpp3 trong nhóm liên kết C2 trên NST số 6. Gen Rpp4 cũng đã được định vị thuộc nhóm liên kết G trên NST 18, còn Rpp3 thuộc nhóm liên kết J trên NST 16 và Rpp5 thuộc nhóm N trên NST số 3 [77], [81]. Xu hướng trên thế giới hiện nay là lai các giống kháng chứa các gen kháng khác nhau để tạo ra giống mang đồng thời mang các gen kháng đó. Vì vậy, việc khảo sát tìm kiếm các nguồn giống mang gen kháng chuyên biệt là rất cần thiết. Với các cặp mồi SSR Sat-064, Sct-187, Sat-460, Satt-009, Satt-431, Satt-489; Satt-557 trong các nhóm liên kết G, J, C2, N,
cùng kết hợp với các cặp mồi đa dạng, chúng tôi đã bước đầu nhận được kết quả đa dạng di truyền liên quan đến tính kháng bệnh gỉ sắt.
Sơ đồ hình 3.6 cho thấy các giống đậu tương khác nhau về mặt di truyền phân bố theo khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Như vậy, cũng giống như các chỉ thị phân tử khác, kỹ thuật SSR cho phép xác định nhanh mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu tương tham gia thí nghiệm, điều này rất có ý nghĩa kinh tế trong việc chọn tạo giống cây trồng. Tóm lại, trong số 15 cặp mồi SSR được sử dụng cho 50 giống đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt, có 14 cặp mồi biểu hiện tính đa hình. Đã có 81 phân đoạn DNA được nhân bản, số lượng phân đoạn DNA được nhân bản từ mỗi cặp mồi SSR dao động từ 4 đến 8 phân đoạn. Giá trị PIC biến động từ 0,473 (Satt042) đến 0,798 (Satt175), đạt trung bình là 7,29. Trong 15 cặp mồi có 10 cặp mồi cho tính đa hình cao nhất với hệ số đa dạng di truyền trên 0,7. Phân tích đa dạng di truyền trên sơ đồ hình cây cho thấy khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 29%. Những thông tin này là cơ sở cho việc tuyển chọn giống đậu tương kháng bệnh gỉ sắt phục vụ sản xuất, đồng thời cũng là cơ sở cho việc lựa chọn cặp bố mẹ khác xa nhau về mặt di truyền phục vụ công tác lai tạo giống.
Mối tương quan giữa chỉ thị RAPD và SSR khi phân tích đa hình ở đậu tương
Bằng việc áp dụng các chỉ thị phân tử RAPD và SSR, chúng tôi đã đánh giá được sự đa dạng của 50 giống đậu tương Việt Nam. Để so sánh mối tương quan của hai loại chỉ thị phân tử RAPD và SSR với kết quả phân tích đa hình trên 50 giống đậu tương nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy sử dụng chỉ thị RADP có 15/20 (chiếm 75%) mồi biểu hiện tính đa hình trong khi đó ở chỉ thị SSR là 14/15 mồi (chiếm 93.3%), biểu thị tính đa hình cao hơn. Kết quả này có thể giải thích bằng kích thước ngắn và tính ngẫu nhiên của 20 mồi RAPD, do đó chúng chỉ bắt cặp một cách rất ngẫu nhiên với DNA hệ gen. Trong khi đó vì các trình tự SSR là trình tự lặp lại, đã được nghiên cứu và biết trước, chúng lặp lại rất nhiều lần trong cơ thể, do vậy mức độ đa hình của chỉ thị SSR là cao hơn.
Về giá trị PIC, ở chỉ thị RAPD chỉ số PIC giao động từ 0,27 đến 0,86 trong khi đó ở chỉ thị SSR chỉ số này biến động từ 0,473 đến 0,798. Như vậy sử dụng chỉ thị SSR thì biên độ dao động của hệ số đa dạng là tương đối hẹp hơn so với chỉ thị RAPD. Mặt khác, khi sử dụng sơ đồ hình cây để phân tích tính đa dạng di truyền, chúng tôi nhận thấy ở cả 2 chỉ thị RAPD và SSR, 50 giống đậu tương đều được phân thành 2 nhánh lớn với khoảng cách di truyền lần lượt là 21% và 29%, hệ số sai khác di truyền ở chỉ thị SSR là cao hơn so với chỉ thị RAPD. Kết quả này cũng thể hiện ở sự phân nhánh lớn và nhánh phụ của 50 giống đậu tương khi sử dụng hai loại chỉ thỉ thị khác nhau. Kết quả ở chỉ thị RAPD thì 50 giống chỉ được phân làm 2 nhóm chính, trong khi đó ở chỉ thị SSR thì 50 giống được phân thành 5 nhóm nhỏ (I, II, III, IV, V) với hệ số tương đồng khác nhau (hình 3.6).
Điều thú vị là, khi sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 cặp mồi thì sự phân nhóm ở cây phân loại (hình 3.4) chưa cho thấy mối liên hệ chặt chẽ với khả năng phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt. Tuy nhiên, khi sử dụng kỹ thuật SSR với 15 cặp mồi, chúng tôi đã nhận thấy bước đầu có sự phân nhánh theo khả năng kháng bệnh gỉ sắt (hình 3.6). Cây phân loại được phân thành 2 nhánh lớn trong đó nhánh thứ nhất gồm các giống nhiễm bệnh và một giống trung gian, nhánh thứ hai bao gồm các giống kháng bệnh và các giống trung gian. Kết quả này một lần nữa khẳng định, sử dụng phương pháp SSR có độ đa hình cao hơn và tin cậy hơn, đây là cơ sở ban đầu mở ra khả năng tìm kiếm các giống đậu tương Việt Nam mang từng gen kháng chuyên biệt.