Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD-Randomized complete Block design) với ba lần nhắc lại trong khu cách biệt để đánh giá khả năng kháng bệnh.
Kỹ thuật lây nhiễm: Khi lây nhiễm, rửa bào tử trực tiếp trên lá với nư- ớc cất vô trùng, lọc qua 1 lần vải để loại bỏ cặn bẩn, xác định mật độ bào tử trong dịch vẩn bằng buồng đếm Goriaev dưới kính hiển vi và điều chỉnh bằng phương pháp pha loãng. Dịch vẩn bào tử với mật độ 5 x 104 bào tử/ml được đưa đều lên hai mặt lá bằng bình phun với lượng phun 0,5 ml/dm2 lá.
Trình tự nhiễm bệnh được tiến hành như sau:
- Các giống đậu tương được gieo trong nhà lưới trên cùng một nền đất và được chăm sóc với cùng một điều kiện. Khi cây có một lá kép đã mở hoàn toàn, việc lây nhiễm mới được thực hiện.
- Dịch vẩn bào tử với mật độ 5 x 104 bào tử/ml được đưa đều lên hai mặt lá bằng bình phun với lượng phun 0,5 ml/dm2 lá.
Độ ẩm bão hoà được tạo ra trong thời gian 24 giờ bằng cách chụp túi nylon lên cây. Trước đó, cây được tưới đẫm nước, đồng thời mặt trong của túi cũng được phun nước lên. Sau khi lây nhiễm cây được để tối trong 12 giờ và
Tên cặp mồi
Trình tự mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) từ đầu 5’ đến 3’ Tm Tan thực tế Kích
được giữ ở chỗ mát, không có ánh sáng trực tiếp. Sau đó, các cây được để trong điều kiện phát triển bình thường, hoặc được che nắng (trong thời kì tiềm dục) và tưới nước thường xuyên để tạo độ ẩm cao.
Sau 3 tuần lây nhiễm, việc tiến hành đánh giá đặc điểm của vết bệnh, mức độ tạo quầng và mức độ hình thành bào tử theo phương pháp của Nguyễn Thị Bình (dựa trên phương pháp cơ sở của AVRDC) [2]. Song song với phương pháp trên, số lượng vết bệnh trên tổng diện tích lá cũng được đánh giá theo thang 4 điểm: điểm 1 (không có vết bệnh); điểm 2 (từ 1 vết bệnh đến 20% tổng diện tích lá bị bệnh); điểm 3 (21 đến 50% tổng diện tích lá bị bệnh); điểm 4 (trên 50% diện tích lá bị bệnh). Từ thang 4 điểm, chúng tôi tính chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian AUDPC (Area Under Disease Progress Curve) theo công thức sau:
AUDPC = ∑[ (Yi + Yi+1)/2] [ (Ti+1 + Ti)]
Trong đó: Yi: chỉ số bệnh ở ngày điều tra i Yi+1: Chỉ số bệnh ở ngày điều tra i+1 T i: Ngày theo dõi bệnh ở thời điểm i Ti+1: Ngày theo dõi bệnh ở thời điểm i +1
Chỉ số AUDPC được sử dụng để phân tích thống kê theo chương trình SAS [41]. Khả năng kháng bệnh được xác định thông qua chỉ số AUDPC của giống kháng và giống nhiễm bệnh dùng làm đối chứng so với các giống cần phân tích, đồng thời kết hợp với các phân tích về phản ứng bệnh, khả năng tạo bào tử, tạo quầng.
Bố trí thí nghiệm gây nhiễm bệnh ở lá cho nghiên cứu 2-DE:
C¸c gièng ®Ëu t¬ng: NhËp néi: §Þa ph¬ng NhiÔm bÖnh DT12 VMK Kh¸ng bÖnh DT2000 CBU8325
Các giống đậu tương được gieo trồng tại Viện Bảo vệ Thực vật, khi cây bắt đầu ra lá sò, chuyển sang nhà lưới Viện Công nghệ sinh học chăm sóc để tránh những tác động bên ngoài, cách ly chậu đối chứng với chậu thí nghiệm, khi cây có lá kép bắt đầu gây nhiễm bệnh.
A
B
Hình 2.1. Hình ảnh cây thí nghiệm nhiễm bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm A (đối chứng) và B (thí nghiệm)
2.2.2. Phương pháp phân tích hoá sinh
Mẫu nghiên cứu được chuẩn bị như sau: hạt khô được bóc vỏ, tách lấy hai lá mầm và nghiền nhỏ thành bột mịn. Bột được bảo quản trong lọ có nút kín ở 40C.
2.2.2.1. Xác định hàm lượng lipid tổng số
Lipit trong hạt đậu tương được chiết rút bằng dung môi hữu cơ (petroleum ether) và xác định hàm lượng theo công thức sau đây:
Hàm lượng lipid (%) =
A-B
A x100%
A: Khối lượng mẫu ban đầu
B: Khối lượng mẫu sau khi loại lipid
2.2.2.2. Xác định hàm lượng protein tan tổng số
Protein tan tổng số được chiết bằng dung dịch đệm phosphate citrate (pH 10) và NaCl 1M và xác định bằng thuốc thử Foling sử dụng máy quang phổ UV, bước sóng hấp thụ 750nm. Hàm lượng protein được tính theo đồ thị đường chuẩn (hình 2.2). 4.0 std5 Abs 3.0 Std 4 Std 3 2.0 Std 2 1.0 Std 1 0.0 Blank -0.01 0.0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.11 0.12 0.13 Reading vs. Concentration mg
2.2.2.3 Xác định thành phần amino acid trong hạt đậu tương
20 giống đậu tương được lựa chọn, mỗi mẫu cân 100g hạt sau đó mẫu hạt đậu tương được sấy khô ở trong 20 phút đến khối lượng không đổi. Sau khi sấy, hạt được nghiền nhỏ và hòa tan trong dung dịch acid HCl 6N. Mẫu được thủy phân trong dung dịch acid HCl ở nhiệt độ 110oC qua đêm. Sau khi thủy phân protein, các amino acid được chiết qua giấy lọc, xử lý và được phân tích trên máy phân tích amino acid tự động - HPLC amino Quan Series II (Hewlett Parkard, Hoa Kỳ) tại phòng Hóa sinh protein, Viện Công nghệ sinh học.
2.2.3. Các phương pháp phân tích đa dạng di truyền DNA
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết và tinh chế DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ mầm đậu tương. Mầm hạt được chuẩn bị bằng cách ngâm hạt khô trong nước cất 1 giờ, cho hạt nẩy mầm trên giấy lọc trong hộp lồng ở buồng tối, khi mầm dài khoảng 2cm, tách riêng lấy phần thân mầm rồi bảo quản trong tủ lạnh sâu (-200C).
Lượng mầm đậu tương khoảng 300-500mg được nghiền trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn. Sau đó, mẫu được hoà trong 3ml đệm chiết (Tris HCl 0,1M pH 8; EDTA 0,5M pH 8; NaCl 6M; β - Mecaptoethanol (0,14M; CTAB 4%) ủ 650C trong 90 phút để chiết DNA.
Protein và tạp chất được loại bỏ bằng cách xử lý dịch chiết bằng một thể tích tương đương hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25: 24: 1). Ly tâm để thu lấy pha trên và tiếp theo là xử lý pha đó bằng dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24: 1). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC rồi thu dịch pha trên.
DNA trong dung dịch được tủa bằng ethanol 100% (tỷ lệ thể tích 1: 3) ở -200C trong ít nhất 2 giờ, sau đó ly tâm thu tủa. DNA được rửa lại bằng ethanol 70% hai lần, làm khô trên máy hút chân không SpeedVac trong 5 phút rồi hoà trong 400µl nước cất khử ion vô trùng. Điện di kiểm tra DNA thu được trên gel agarose 0,8%.
Bổ sung 0,1 µl RNase 10 mg/ml vào 100 µl dung dịch DNA, ủ 370C trong 1giờ để loại RNA. Lặp lại bước 2 và 3 đã nêu trên để loại RNase khỏi dung dịch. DNA tinh sạch này được sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3.2. Phương pháp xác định DNA bằng quang phổ
Nguyên tắc của phương pháp đo quang phổ là dựa vào sự hấp thụ mạnh của tia tử ngoại ở bước sóng 260nm và 280nm của các purin và primidin. Một đơn vị OD260nm (Optical Density260nm) tương ứng với nồng độ là 50 µg/ml cho dung dịch DNA sợi đôi. Do đó, nồng độ DNA trong mẫu được tính theo công thức (2.3):
CDNA (µg/ml) = OD260nm x50 x hệ số pha loãng (2.3)
Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, chúng tôi đo OD ở giá trị 280nm (OD280nm). Dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không lẫn protein) khi tỉ số OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2.
2.2.3.3. Điện di DNA trên gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose: Cân một lượng agarose thích hợp vào 100 ml dung dịch đệm TAE. Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu được dịch trong suốt. Để nguội đến khoảng 50 - 600C, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lược. Sau một thời gian gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE.
- Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thích hợp với đệm tra mẫu, tra vào “giếng” trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng điện 60 - 80 mA trong khoảng 30 phút.
- Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr có nồng độ 0,5 µl/ml. Lấy bản gel ra sau 10 - 15 phút và rửa trong nước sạch.
2.2.3.4. Điện di DNA trên gel polyacrylamide và nhuộm bạc
Điện di các đoạn DNA nhỏ được tiến hành trên gel polyacrylamide 15% trong dung dịch đệm TBE với hiệu điện thế 100V trong 3 giờ. Sau đó gel nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến. Công thức đổ gel và nhuộm bạc được trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần gel và sơ đồ nhuộm bạc theo phương pháp cải tiến
Trong phương pháp này, gel sau khi điện di đựơc cố định và nhuộm trong dung dịch chứa 5% ethanol, 1% nitric acid và 0,1% AgNO3 trong 5 phút. Gel sau đó rửa nhanh với nước tinh khiết trong 10 giây và nhúng vào dung dịch chứa 3% NaOH, 0,65% Na2CO3, và 0,4% HCOH (formaldehyde) từ 2 đến 3 phút. Cuối cùng nhúng vào dung dịch chứa 5% ethanol và 1% nitric acid trong vòng 1 phút. Sản phẩm sẽ được chụp để phân tích. 2.2.3.5. Phân tích đa hình bằng kỹ thuật RAPD
Phản ứng khuếch đại DNA sử dụng các mồi RAPD được tiến hành trong thể tích 25 µl. Thành phần và chu trình nhiệt của PCR-RAPD được mô tả như sau: Gel acrylamide 15% (V = 8ml) 4ml Acrylamide/bis 30%; 1,6ml TBE 5X, 2,4ml H2O, 40µl APS 10%, 5 µl TEMED Phương pháp nhuộm bạc
1. Cố định: dung dịch acid acetic 10% trong 30 phút 2. Rửa: nước cất trong 10 phút
Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR - RAPD có tổng thể tích 25 µl bao gồm: MgCl2 (1,6 mM); 2 mM dNTPs; đoạn mồi 10 pm; 1 đơn vị Taq
polymerase và 10 ng DNA khuôn. Phản ứng PCR- RAPD thực hiện trong máy PCR- Thermal Cycler PTC 100 theo chu kỳ nhiệt: 940C - 3 phút; 35 chu kỳ: 920C - 1 phút; 350C/ 1 phút; 720C/ 1phút. Sau đó 720C - 10 phút; lưu giữ ở 40C. Điện di phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1,4% ở điện áp 120V trong 2 giờ. Nhuộm gel bằng ethidium bromide soi và chụp ảnh trên máy Gel Doc (Bio-Rad, Mỹ). Chỉ những phân đoạn DNA có độ nét trung bình trở lên mới được ghi nhận. Những phân đoạn DNA mờ không được sử dụng cho phân tích cuối cùng.
2.2.3.6. Phân tích đa hình bằng kỹ thuật SSR
Phản ứng PCR-SSR được tiến hành với chu trình nhiệt là: 950C: 4phút; 35 chu kỳ: 950C: 1 phút, 450C - 580C (tuỳ từng cặp mồi): 45 giây, 720C: 1 phút, kết thúc 720C: 9 phút; lưu giữ ở 4oC
Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR- SSR trong 25 ml bao gồm : MgCl2 (1,6 mM); 2 mM dNTPs; đoạn mồi 10 pm; 1 đơn vị Taq DNA polymerase và 10 ng DNA khuôn.
Điện di phân tích sản phẩm PCR -SSR trên gel polyacrylamide 15% ở hiệu điện thế 100V trong 3 giờ. Nhuộm gel bạc và chụp ảnh trên máy Gel Doc (Bio-Rad, Mỹ) để phân tích.
2.2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
- Phân tích các tính trạng số lượng theo phương pháp thống kê sinh học. Các trị số thống kê được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel, ở mức ý nghĩa α = 0,05 hoặc α= 0,01.
- Xử lý kết quả phân tích RAPD, SSR
Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm PCR và sự xuất hiện các băng SSR của các giống đậu tương đối với các mồi để làm cơ sở cho việc phân tích số liệu.
Phân tích số liệu theo quy ước: - Số 1 - xuất hiện băng SSR - Số 0 - không xuất hiện băng SSR.
Các số liệu này được nhập vào phần mềm Excel theo từng mồi.
Hệ số đa dạng di truyền H - genetic diversity index [87] cho mỗi chỉ thị phân tử được tính theo công thức : H = 1 - ∑ Pi2
Trong đó Pi là tần suất lặp alen thứ i của mỗi chỉ thị phân tử.
- Lập sơ đồ hình cây: Số liệu được đưa vào phần mềm chuyên dụng
NTSYS pc version 2.0 để tìm ra sự sai khác giữa các giống đậu tương thông qua biểu đồ cây ở hệ số tương đồng DICE [120]. Phân tích và đánh giá hệ số tương quan kiểu hình theo phương pháp phân nhóm UPGMA.
2.2.4. Các phương pháp phân tích đa hình protein
2.2.4.1 Tách chiết protein từ lá đậu tương
Tách chiết protein từ lá đậu tương để tiến hành điện di SDS-PAGE và điện di 2-DE theo phương pháp được mô tả sau đây [14]:
- Lá đậu tương của các lô đối chứng và xử lý gây nhiễm bệnh sau khi nhiễm bệnh 6; 9 ngày được chọn để nghiên cứu. Lá được làm sạch và cất giữ ở -80oC cho đến khi sử dụng.
- Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng.
- Làm đồng nhất trong 5 thể tích 10% TCA trong acetone có chứa 0,07% (w/v) DTT ủ ở -20oC trong 2 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC.
- Cặn ly tâm được rửa lại bằng acetone có chứa 0,07% (w/v) DTT, 1mM PMSF, 2mM EDTA: làm đồng nhất trong dung dịch , ủ -20oC trong khoảng 20 phút. Ly tâm 13 000 vòng/phút, trong 30 phút ở 4oC (Mỗi lần ly tâm xong, đổ bỏ dung dịch bên trên, đảo đều cặn, không để vón cục, bổ sung dung dịch aceton và khuấy đều).
- Để bay hơi cho hết acetone ở nhiệt độ phòng sau khi đã làm tơi cặn, khoảng 20-30 phút.
- Cặn được hòa vào dung dịch 0,1 Tris-HCl pH 7 để điện di SDS- PAGE. Để tiến hành điện di 2-DE, cặn được hòa vào dung dịch có chứa: 9,0 M urea, 4% CHAPS, 100 mM DTT và 2% IPG buffer (1,6% Bioampholite 5/7 + 0,4 % Bioampholite3/10) theo tỉ lệ:cặn thu được từ 0,5g lá hòa vào 400
µl dung dịch.
- Để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó siêu âm 2 lần, mỗi lần 20 phút trong đá lạnh, mẫu được giữ ở -80oC.
2.2.4.2. Điện di SDS-PAGE
Điện di protein trên gel SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là phương pháp phân tách protein hoặc polypeptide dựa vào tốc độ dịch chuyển khác nhau của chúng trong điện trường.
Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS được tiến hành theo mô tả trong công trình của Trần Thị Phương Liên và cộng sự (1996) [11]. 15 µg protein lá của các giống đậu tương được lựa chọn phân tích được hòa vào đệm điện di và biến tính ở 100oC trong 10 phút, sau đó mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút để loại cặn.
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide Các thành phần Gel cô đặc (4%) Gel phân tách (12,5%) Nước cất (ml) 1,2 2,5 Tris HCL0,5M (ml) pH6,8 0,5 - Tris HCL1,5M (ml) pH8,8
Điện di được tiến hành trên máy điện di của hãng Bio-Rad với kích thước gel 9x5,5cm; độ dày 0,75mm. Ở đây chúng tôi sử dụng gel cô mẫu là 4% (Tris 0,125M; pH 6,8), gel tách mẫu là 12,5 % (Tris 0,375M, pH 8,8). Thành phần điện di được mô tả như bảng 2.5
Điện di được tiến hành trong dung dịch đệm Tris - glyxin (Tris 0,025M; glyxin 0,193M) có chứa SDS 1%, pH 8,3; hiệu điện thế 90V trong 4 giờ. Sau đó, bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomasie G-250 0,1% trong 30 phút rồi rửa bằng dung dịch tẩy màu (20% methanol, 7% axetic acid).
Bộ thang protein chuẩn (Fermentas): bao gồm β - galactosidase (116,0 kDa), bovine serum albumin (66,2 kDa), ovalbumin (45,0 kDa), lactate dehydrogenase (35,0 kDa), restriction endonuclease Bsp98l (25,0 kDa), β- lactoglobulin (18,4 kDa), lysozyme (14,4 kDa).
2.2.4.3. Điện di hai chiều – 2-DE
Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau. Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bởi nguyên lý hội tụ theo điểm đẳng điện IEF (isoelectric focusing) trên một thanh cố định gradient pH (ví dụ dải pH 3-10). Chiều thứ hai, các phân tử protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamide (như điện di SDS-PAGE). Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, chiều thứ nhất theo điện tích và chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử.
Điện di chiều 1 được thực hiện trên máy điện di đẳng điện PROTEAN