các giống đậu tương nghiên cứu, kết quả kiểm tra trên máy quang phổ ở bước sóng λ=260/280nm cho thấy các mẫu DNA có tỷ lệ OD 260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8-2,0. Kết quả này đã đáp ứng đủ yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để có thể tiến hành các thí nghiệm phân tích sự đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA.
3.3.1. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉthị phân tử RAPD thị phân tử RAPD
Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu sự đa dạng về mức độ phản ứng đối với bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương đã khắc phục được những thiếu sót và hạn chế của phương pháp truyền thống trước đây [8]. Trong thí nghiệm này, 20 mồi RAPD (bảng 2.2) đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng trong hệ gen của 50 giống đậu tương trồng tại Việt Nam có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt nhằm cung cấp thông tin có giá trị cho công tác chọn tạo giống đậu tương.
Kết quả nhân bản và tỷ lệ xuất hiện các phân đoạn DNA
Phản ứng RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên được thực hiện và sản phẩm RAPD được điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm gel, chụp ảnh và phân tích tính đa hình DNA (Hình 3.2 và Hình 3.3).
Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng phản ứng RAPD từ hệ gen của 50 giống đậu tương cho thấy trong 20 mồi đã có 15 mồi biểu hiện tính đa hình. Với mỗi mồi ngẫu nhiên, số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản dao động từ 2-10 phân đoạn với kích thước từ 250bp-2000bp.
Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được từ hệ gen của 50 giống đậu tương là 3380 phân đoạn, trong đó mồi M14 có số đoạn DNA nhân bản là nhiều nhất (335 phân đoạn DNA) (hình 3.2) và ít nhất là mồi M8 (9 phân đoạn).
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14
(M: Thang chuẩn DNA kích thước 1kb; 1-50: thứ tự tương ứng với tên của 50 giống đậu tương ở bảng 3.1)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 kb 750 bp 500 bp 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 M 1 kb 750 bp 500 bp M 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 M 1 kb 750 bp 500 bp
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18
(M: Thang chuẩn DNA kích thước 1 kb; 1-50: thứ tự tương ứng với tên của 50 giống đậu tương ở bảng 3.1)
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA đa hình của 20 mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR - RAPD là 113 đoạn. Trong đó có 73 phân đoạn đa hình (chiếm 64,6%) và 40 đoạn không có tính đa hình (chiếm 35,4%). Bảy mồi (M2, M3, M4, M9, M10, M13 và M18) có tính đa hình hoàn toàn (100%) và năm mồi (M5, M8, M12, M16 và M17) không cho tính đa hình (0%). Trong đó có 14/20 mồi có số phân đoạn đa hình trên 50%, mồi M14 có số phân đoạn đa hình bằng 50% (Hình 3.2), mồi M18 số phân đoạn đa hình là 100% (Hình 3.3).
Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình thể hiện ở giá trị PIC (bảng 3.4). Cụ thể, giá trị PIC của mồi M14 là 0,27 (tỷ lệ đa hình là 50%) và giá trị PIC của mồi M4 là 0,86 (đa hình cao nhất), trong đó 13/20 mồi cho giá trị PIC ≥ 0,5.
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn DNA khi so sánh giữa các giống khi phân tích với mỗi mồi RAPD. Chẳng hạn tại vị trí khoảng 0,25 - 0,5 kb tại giếng 3 (PI462312), và 30 (CV) đã xuất hiện phân đoạn DNA mới khi phân tích với mồi số 14, hay tại vị trí khoảng 1,5 kb giếng 6 (CBU8325), 7 (DT95), 16 (PHCB), 42 (MT2), 43 (MH) và 44 (DL) phân đoạn DNA không xuất hiện khi phân tích với mồi TRA4.
Bảng 3.4. Tỉ lệ phân đoạn đa hình và giá trị PIC của các mẫu nghiên cứu
STT Mồi PIC Tổng số đoạn đa hình % đoạn đa hình STT Mồi PIC Tổng số đoạn đa hình % đoạn
Mối quan hệ di trưyền của 50 giống đậu tương phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt
Để có bức tranh tổng quát về mối quan hệ giữa 50 giống đậu tương nghiên cứu ở mức độ phân tử trên cơ sở phân tích RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên, chúng tôi đã thiết lập được sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương (Hình 3.4). Kết quả cho thấy 50 giống đậu tương phân bố làm 2 nhánh lớn (nhánh I và nhánh II).
Nhánh I chỉ có 2 giống VK2 và DT12, có khoảng cách di truyền so với 48 giống còn lại là 21% (1 - 0,79).
Nhánh II gồm 48 giống đậu tương còn lại có khoảng cách di truyền dao động từ 0% đến 15%. Đáng lưu ý là hầu hết các giống có cùng nguồn gốc địa lý lập thành một nhóm nhỏ trên cây phân loại. Điển hình, có 4 mẫu PI200492, PI230970, PI462312, PI459025 có nguồn gốc từ Nhật, Ấn Độ và Trung Quốc lập thành một nhóm phụ. Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chưa phát hiện được sự sai khác giữa hai giống DT95 và HSP1.
So sánh với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Đức Thuận và cộng sự (2006) được tiến hành trên 30 giống đậu tương (từ Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long) với 13 cặp mồi RAPD, kết quả cho thấy có 9 mồi thể hiện sự đa hình, đồng thời có 4 nhóm (nhóm A, B, C, D) được phân chia với hệ số tương đồng từ 0,8-0,98 [21]. Hệ số này giao động khá hẹp so với nghiên cứu của chúng tôi (hệ số tương đồng 0,27-0,86). Như vậy, với 20 mồi ngẫu nhiên, chúng tôi cho thấy độ đa dạng của các giống nghiên cứu cao hơn so với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Đức Thuận và cộng sự (2006). Ngoài ra, kết quả phân tích tính đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD còn tìm thấy ở công bố của Đinh Thị Phòng và cộng sự (2008) [18] và của Vũ Thị Anh Đào (2011) [4].
Như vậy, sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên để phân tích DNA hệ gen của 50 giống đậu tương chúng tôi đã cho thấy mức độ đa dạng di truyền giữa các giống đậu tương nghiên cứu. Kết quả có 15 mồi biểu hiện tính đa hình với giá trị PIC dao động từ 0,27 (mồi M14) đến 0,86 (mồi M4), trong
đó 13 mồi cho giá trị PIC ≥ 0,5. Khoảng cách di truyền và biểu đồ hình cây (dendrogram) được thiết lập dựa trên hệ số tương đồng di truyền và phương pháp phân nhóm UPGMA, 50 giống đậu tương nghiên cứu được phân bố ở các nhóm thuộc 2 nhánh trong cây phát sinh. Nhánh I chỉ có 2 giống VK2 và DT12, có hệ số sai khác di truyền so với 48 giống còn lại khoảng 21%. Xét về khả năng phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt, chúng tôi nhận thấy sự phân nhánh của các giống đậu tương khá ngẫu nhiên, chưa theo đặc tính kháng bệnh một cách rõ nét.
Từ những dữ liệu trên cho thấy, tính đa hình DNA của 50 giống đậu tương trong phạm vi 20 cặp mồi RAPD đã minh chứng cho sự khác nhau trong cấu trúc DNA của các giống đậu tương nghiên cứu.
Nhánh thứ hai
Nhánh thứ nhất
Hình 3.4. Sơ đồ hình cây của 50 giống đậu tương dựa trên hệ số tương đồng di truyền xác định bằng chỉ thị RAPD và kiểu phân nhóm UPGMA