2.2.4.1 Tách chiết protein từ lá đậu tương
Tách chiết protein từ lá đậu tương để tiến hành điện di SDS-PAGE và điện di 2-DE theo phương pháp được mô tả sau đây [14]:
- Lá đậu tương của các lô đối chứng và xử lý gây nhiễm bệnh sau khi nhiễm bệnh 6; 9 ngày được chọn để nghiên cứu. Lá được làm sạch và cất giữ ở -80oC cho đến khi sử dụng.
- Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng.
- Làm đồng nhất trong 5 thể tích 10% TCA trong acetone có chứa 0,07% (w/v) DTT ủ ở -20oC trong 2 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC.
- Cặn ly tâm được rửa lại bằng acetone có chứa 0,07% (w/v) DTT, 1mM PMSF, 2mM EDTA: làm đồng nhất trong dung dịch , ủ -20oC trong khoảng 20 phút. Ly tâm 13 000 vòng/phút, trong 30 phút ở 4oC (Mỗi lần ly tâm xong, đổ bỏ dung dịch bên trên, đảo đều cặn, không để vón cục, bổ sung dung dịch aceton và khuấy đều).
- Để bay hơi cho hết acetone ở nhiệt độ phòng sau khi đã làm tơi cặn, khoảng 20-30 phút.
- Cặn được hòa vào dung dịch 0,1 Tris-HCl pH 7 để điện di SDS- PAGE. Để tiến hành điện di 2-DE, cặn được hòa vào dung dịch có chứa: 9,0 M urea, 4% CHAPS, 100 mM DTT và 2% IPG buffer (1,6% Bioampholite 5/7 + 0,4 % Bioampholite3/10) theo tỉ lệ:cặn thu được từ 0,5g lá hòa vào 400
µl dung dịch.
- Để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó siêu âm 2 lần, mỗi lần 20 phút trong đá lạnh, mẫu được giữ ở -80oC.
2.2.4.2. Điện di SDS-PAGE
Điện di protein trên gel SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) là phương pháp phân tách protein hoặc polypeptide dựa vào tốc độ dịch chuyển khác nhau của chúng trong điện trường.
Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS được tiến hành theo mô tả trong công trình của Trần Thị Phương Liên và cộng sự (1996) [11]. 15 µg protein lá của các giống đậu tương được lựa chọn phân tích được hòa vào đệm điện di và biến tính ở 100oC trong 10 phút, sau đó mẫu được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút để loại cặn.
Bảng 2.5. Thành phần gel polyacrylamide Các thành phần Gel cô đặc (4%) Gel phân tách (12,5%) Nước cất (ml) 1,2 2,5 Tris HCL0,5M (ml) pH6,8 0,5 - Tris HCL1,5M (ml) pH8,8
Điện di được tiến hành trên máy điện di của hãng Bio-Rad với kích thước gel 9x5,5cm; độ dày 0,75mm. Ở đây chúng tôi sử dụng gel cô mẫu là 4% (Tris 0,125M; pH 6,8), gel tách mẫu là 12,5 % (Tris 0,375M, pH 8,8). Thành phần điện di được mô tả như bảng 2.5
Điện di được tiến hành trong dung dịch đệm Tris - glyxin (Tris 0,025M; glyxin 0,193M) có chứa SDS 1%, pH 8,3; hiệu điện thế 90V trong 4 giờ. Sau đó, bản gel được nhuộm bằng dung dịch Coomasie G-250 0,1% trong 30 phút rồi rửa bằng dung dịch tẩy màu (20% methanol, 7% axetic acid).
Bộ thang protein chuẩn (Fermentas): bao gồm β - galactosidase (116,0 kDa), bovine serum albumin (66,2 kDa), ovalbumin (45,0 kDa), lactate dehydrogenase (35,0 kDa), restriction endonuclease Bsp98l (25,0 kDa), β- lactoglobulin (18,4 kDa), lysozyme (14,4 kDa).
2.2.4.3. Điện di hai chiều – 2-DE
Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là sự kết hợp của hai nguyên lý phân tách khác nhau. Theo chiều thứ nhất, các phân tử protein được phân tách dựa theo điểm đẳng điện pI bởi nguyên lý hội tụ theo điểm đẳng điện IEF (isoelectric focusing) trên một thanh cố định gradient pH (ví dụ dải pH 3-10). Chiều thứ hai, các phân tử protein được phân tách trên điện di trên gel polyacrylamide (như điện di SDS-PAGE). Do đó, thực chất 2-DE là phương pháp phân tách protein theo 2 chiều, chiều thứ nhất theo điện tích và chiều thứ hai theo trọng lượng phân tử.
Điện di chiều 1 được thực hiện trên máy điện di đẳng điện PROTEAN IEF với thanh cố định gradient pH (ReadyStrip IPG strip); 7cm; pH 3-10 của Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, Mỹ) sử dụng các qui trình và hóa chất như đã được mô tả [14]. Gel 2-DE được chụp, phân tích và so sánh hình ảnh với sự hỗ trợ của phần mềm Progenesis SameSpotrs (Nonlinear Dynamics, Anh).
Điện di chiều thứ nhất (điện di đẳng điện)
110 µg protein lá các mẫu DT12, VMK, CBU8325, DT2000 ở các thời điểm 9 ngày được hòa trong 120 µl đệm mẫu (9M urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 0,2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholyte và Bromophenol Blue). Các thanh được đúc sẵn tạo giải pH chính xác và thuận tiện khi sử dụng. Mẫu được thấm qua đêm vào trong các thanh cố định gradient pH 3-10, dài 7cm. Sau đó, các thanh này được tiến hành điện di chiều một trên hệ PROTEAN IEF (Bio-Rad) theo chương trình hiệu điện thế: (i) 250V trong 30 phút; (ii) 4000V trong 3 giờ; (iii) 4000V sao cho VHOUR cuối cùng đạt 11000V.
Cân bằng gel
Sau quá trình điện di đẳng điện, protein trên gel được khử bằng dung dịch khử (6 M urea, 20% glycerol, 2% SDS và 37,5 mM Tris-HCl pH 8.8, 2% DTT w/v) và alkyl hóa bằng dung dịch (6 M urea, 2% SDS 37.5 mM Tris- HCl pH 8.8, glycerol 20% and 40 mM IAA).
Điện di chiều hai
Protein trong thanh pH 3-10 sau khi điện di chiều thứ nhất và cân bằng được tiến hành chạy chiều thứ hai (SDS-PAGE) trên gel polyacrylamide 12,5% với điện thế 80V trong 10 phút, 120V trong 30 phút và 150V trong 2 giờ. 2.2.4.4. Nhuộm protein và phân tích hình ảnh gel
Protein sau khi điện di 2-DE được cố định 30 phút trong dung dịch acetic acid 5%. Sau đó được nhuộm bằng dung dịch thuốc nhuộm Coomassie G250 (0.05% coomassie blue G-250, 50% methanol, 10% acetic acid). Gel 2- DE được chụp lại và phân tích hình ảnh với sự hỗ trợ của phần mềm
Progenesis SameSpots (Nonlinear Dynamics, Anh). Các điểm protein được so sánh vị trí tương đồng và định lượng mức độ biểu hiện. Các thí nghiệm so sánh bằng điện di được lặp lại 3 lần.
2.2.4.5. Nhận diện protein trên bản điện di 2DE bằng khối phổ
Các điểm protein được lựa chọn trên bản điện di 2-DE được cắt ra từ bản gel polyacrylamide, gel được rửa, xử lý và thủy phân bằng enzyme trypsin sau đó phân tích trên hệ thống khối phổ ESI-Q TRAP của hãng Bruker. Quá trình phân tích và nhận diện protein trên gel 2-DE được thực hiện tại Phòng Proteomics, Viện Hàn lâm Khoa học, Đài Loan.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN