Hạt của các giống đậu tương được gieo trồng tại các khu cách biệt trong vườn thí nghiệm của Viện Bảo vệ thực vật. Khi cây non có một lá kép đã mở hoàn toàn, bắt đầu tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo. Bào tử nấm sau khi được phun nhiễm trên bề mặt lá, bắt đầu nẩy mầm tạo ra các ống bào tử có kích thước 5 - 400 µm có khả năng mọc lan trên bề mặt lá cho đến khi hình thành các dạng u lồi giữa hai tế bào biểu mô kề nhau. Các u này xuyên qua lớp cutin rồi đi vào trung tâm của các tế bào biểu mô hình thành quầng vàng. Sau 3 tuần lây nhiễm, các vết bệnh mới biểu hiện rõ trên bề mặt lá. Phản ứng của cây đối với bệnh được theo dõi trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Phản ứng của các giống đậu tương đối với bệnh gỉ sắt
STT Giống Bào tử Quầng Vàng Chỉ số AUDPC Phản ứng 1. PI200492 Ít Không 57,45h
STT Giống Bào tử Quầng Vàng Chỉ số AUDPC Phản ứng 10. PMTQ Ít Không 60,13h Kháng 11. HSP2 Ít Không 59,76i Kháng 12. HSP1 Ít Không 58,45h Kháng 13. ZG Ít Không 57,96i
50 giống đậu tương có nguồn gốc từ nhiều địa phương trong cả nước và một số dòng nhập nội thể hiện rõ sự đa dạng về hình thái: màu sắc hạt, rốn hạt, chiều cao cây, phân nhánh... Các giống đậu tương tham gia đánh giá khả
STT Giống Bào tử Quầng Vàng Chỉ số AUDPC Phản ứng 32. SL Nhiều Rộng 61,99c Nhiễm 33. VMK Nhiều Rộng 75,64 b Nhiễm 34. HG Nhiều Rộng 71,25c Nhiễm 35.
năng kháng bệnh gỉ sắt có thời gian sinh trưởng biến động từ 90 đến 110 ngày, hầu hết các hoa có màu trắng và tím. Đặc biệt, sự biểu hiện bệnh ở các giống trong suốt thời gian sinh trưởng là rõ rệt. Thí nghiệm sử dụng hai giống quốc gia làm đối chứng kháng (DT2000) và đối chứng nhiễm (DT12) do hai giống này được coi là giống chuẩn có tính kháng bệnh (DT2000) hoặc mẫn cảm với bệnh (DT12) ổn định và lâu dài. Phân tích số liệu bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy giống có giá trị AUDPC càng thấp, càng có khả năng kháng bệnh vì mức độ tích lũy bệnh thấp và ngược lại. Tuy nhiên, ở một số giống trung gian, mặc dù chỉ số tích lũy AUDPC cao nhưng phản ứng bệnh là trung gian. Điều này có thể giải thích là phản ứng trung gian bao gồm sự hiện diện của cả phản ứng kháng và nhiễm. Trong đó, phản ứng nhiễm nhiều hơn, nên những giống này vẫn có thể có chỉ số AUDPC cao. Song song với quá trình theo dõi mức độ nhiễm bệnh bằng phương pháp đánh giá phần trăm vết bệnh trên diện tích lá qua chỉ số AUDPC, chúng tôi còn đánh giá thêm các chỉ tiêu về: phản ứng giống đối với bệnh, mức độ hình thành bào tử, mức độ tạo quầng. Kết quả là 50 giống đậu tương được chia làm 3 nhóm có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt:
Nhóm kháng bệnh gỉ sắt bao gồm 13 giống: PI200492, PI230970, PI462312, PI459025, DT2000, CBU8325, DT95, MTD65, CNB, PMTQ, HSP2, HSP1, ZG: thể hiện phản ứng kháng bệnh rất rõ với các vết bệnh có màu nâu đen, số lượng bào tử ít, không có quầng vàng, tốc độ phát triển của bệnh chậm. Trong số đó có đại diện của các vùng như (i) miền Bắc: CBU8325 (Cao Bằng); PMTQ, HSP1, HSP2 (Hà Giang), CNB (Thái Nguyên); (ii) Tây Nguyên: ZG; (iii) Nam bộ: MTD 65; Ngoài ra, còn có 4 giống kháng bệnh chuẩn: PI200492, PI230970, PI462312, PI459025 chứa 4 gen tương ứng Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 và hai giống được gieo trồng đại trà: DT2000 và DT95. Đặc biệt, kết quả nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy có 6 giống kháng mới đã được phát hiện là PMTQ, HSP1, HSP2, CNB, ZG và MTD65.
Nhóm trung gian bao gồm 12 giống: M103, DT96, PHCB, PS, PT, NS, MT1, HG2, VK2, CT2, VK3, CT1, mang đặc điểm của hai loại vết bệnh nhiễm và kháng. Đại diện cho vùng miền Bắc có PHCB, PS (Cao Bằng); Kon Tum: NS; Nam bộ: PT, MT1, HG2, VK2, CT2, VK3, CT1. Trong đó còn có hai giống đang được gieo trồng đại trà là M103 và DT96.
Nhóm mẫn cảm với bệnh gồm 25 giống: DT12, VX92, VX93, DT84, V79, SL, CV, VMK, HG, DK, CBD, CB7, QHCB, LVG, TTHT, DBBT, DTBT, MT2, HG1, HTDT, MD, DL, MH, ND, CSGL, HN. Các giống này có phản ứng nhiễm bệnh rất rõ, các lá bệnh thường có nhiều vết bệnh, ở mặt dưới lá bào tử hình thành nhiều và nhanh, vết bệnh có màu nâu vàng của gỉ sắt, xung quanh nốt bệnh thường có quầng vàng, lá thường bị úa vàng nhanh và dễ rụng. Các giống địa phương miền Bắc có thể kể đến là SL, CV, VMK, HG, DK, CBD, CB7, QHCB, LVG, TTHT, Tây nguyên: HTDT, MD, DL, CSGL; Nam bộ: DBBT, DTBT, MT2, HG1, MH, ND, HN. Một số giống được gieo trồng đại trà không có khả năng kháng bệnh là DT12, VX92, VX93, DT84, V79. Hình 3.1 minh họa 3 mức độ phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương.
1 2 3
Hình 3.1. Lá của các giống đậu tương ở 3 mức độ phản ứng với bệnh gỉ sắt
1- Kháng bệnh (DT2000); 2- Trung gian (M103); 3- Nhiễm bệnh (DT12);
Việc khảo sát nguồn gen kháng bệnh bắt đầu từ việc đáng giá khả năng kháng bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương trong một số tập đoàn giống ở nhiều vùng trong cả nước là vấn đề rất cần thiết. Kết quả này đã khẳng định
sự phù hợp với nhận xét của một số tác giả trước đây [13], [18], [21], [23]. Đó là giống kháng bệnh vẫn còn bảo tồn được gen kháng theo thời gian, đồng thời đã tìm ra một số giống đậu tương kháng mới ở các mức độ khác nhau. Những giống kháng mới được chúng tôi phát hiện bao gồm 6 giống: PMTQ, HSP1, HSP2 (Hà Giang), CNB (Thái Nguyên), ZG (Tây Nguyên), MTD65 (Nam Bộ). Các giống này được sưu tập từ vùng núi miền Bắc, Tây Nguyên và do trường Đại học Cần thơ cung cấp [18], [21], [23].
3.2. Phân tích đặc điểm hóa sinh hạt của các giống đậu tương nghiên cứu
Trên cơ sở sự đánh giá khả năng kháng bệnh của các giống tham gia thí nghiệm, chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt nhằm đánh giá chất lượng hạt, cung cấp thông tin cần thiết cho việc chọn giống có năng suất cao, phẩm chất tốt để đưa vào sản suất đại trà.
3.2.1. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid trong hạt của các giống đậu tương
50 giống đậu tương được đánh giá phân loại về khả năng kháng bệnh gỉ sắt, sau đó tiếp tục được nghiên cứu trên phương diện hóa sinh. Kết quả phân tích hàm lượng protein tan và lipid tổng số của 50 giống đậu tương nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 cho thấy hàm lượng protein giao động từ 30,5% (giống PMTQ) đến 43,5% (giống DT2000, DT96 và TTHT). Trong khi đó, hàm lượng lipid giao động từ 11,35% (giống PMTQ) đến 17,4% (các giống DT2000, DT96 và TTHT).
Thông thường, trong hạt đậu tương thường chứa từ 35%-45% chất đạm, 15-20% chất béo và các chất khác. Kết quả phân tích hàm lượng protein và lipid của hạt 50 giống đậu tương phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Chu Hoàng Mậu (2002) [15].
Qua phân tích số liệu ở bảng 3.2, chúng tôi cũng nhận thấy 3 nhóm kháng bệnh gỉ sắt có hàm lượng protein và lipid như sau:
- Nhóm đậu tương kháng gỉ sắt, bao gồm 13 giống, có hàm lượng protein và lipid trung bình là 36,94% và 12,58 %. Trong đó, giống DT2000 là giống có hàm lượng protein (43,5%) và lipid (17,4%) cao nhất, ngược lại thấp nhất là giống PMTQ có nguồn gốc nhập nội, hàm lượng protein và lipid là 30,5% và 11,35%.
- Nhóm đậu tương trung gian bao gồm 12 giống, trong đó giống DT96 có hàm lương protein (42,9%) và lipid (18,1%) cao nhất, thấp nhất là giống PT có hàm lượng protein (32,8%) và lipid (15,2%), giống này có nguồn gốc từ địa phương.
Bảng 3.2. Hàm lượng protein và lipit trong hạt của 50 giống đậu tương (% so với 100g khối lượng hạt khô)
TT Tên giống Hàm lượng protein Hàm lượng lipit TT Tên giống Hàm lượng protein Hàm lượng lipit 1 PI200492 36,50 ± 0,05 17,30 ± 0,24 26 DT12 35,30 ± 0,11 14,55 ± 0,12 2 PI230970
- Nhóm đậu tương mẫn cảm với bệnh bao gồm 25 giống: Hàm lượng protein và lipid trung bình 37% và 13,25%. Trong đó, giống TTHT có hàm lượng protein và lipid cao nhất là 43,5% và 17,4%, thấp nhất là giống CV (hàm lượng protein 31,2%) và giống ND (hàm lượng lipid 12,6%).
Kết quả phân tích cho thấy, 50 giống đậu tương đem phân tích hóa sinh về hàm lượng protein và lipid đều nằm trong khoảng cho phép và phù hợp với những nghiên cứu trước đây [15]. Trong các cây họ đậu, hạt đậu tương có hàm lượng protein cao nhất, chúng cung cấp nhiều protein hơn là lipid. Protein là một trong hai chỉ tiêu quyết định chất lượng hạt của đậu tương. Mặc dù điều kiện canh tác và yếu tố bất lợi của ngoại cảnh có thể làm ảnh hưởng đến năng suất của đậu tương, song hàm luợng protein của hạt đậu tương vẫn cao hơn hàm lượng protein của các loại ngũ cốc khác.
So sánh hàm lượng protein và lipid giữa 3 nhóm đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt, chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác rõ rệt. Tuy nhiên, trong mỗi nhóm, các giống lai có hàm lượng protein và lipid trong hạt cao hơn các giống địa phương. Điều đó chứng tỏ rằng lai giống và chọn lọc là biện pháp có hiệu quả trong chọn tạo giống đậu tương mới có chất lượng hạt cao, chống chịu bệnh tốt.
16 PHCB 34,50 ± 0,34 13,65 ± 0,13 41 DTBT 42,40 ± 0,22 13,25 ± 0,23 17 PS 33,70 ± 0,07 12,25 ± 0,04 42 MT2 37,60 ± 0,32
3.2.2. Phân tích hàm lượng và thành phần amino acid trong hạt của một số giống đậu tương
Chúng tôi chọn 20/50 giống tham gia thí nghiệm đem phân tích thành phần amino acid trong hạt. Trong đó, có 7 giống kháng (DT2000, DT95, CBU8325, CNB, PMTQ, HSP1, HSP2), 4 giống trung gian (DT96, PHCB, PS, M103) và 9 giống nhiễm (DT12, DT84, VX93, VX92, HG, SL, VMK, QHCB, CV) bao gồm cả giống lai, giống có nguồn gốc từ địa phương và giống nhập nội.
Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, các mẫu protein đậu tương được xử lý và thủy phân bằng HCl đặc để tạo thành các amino acid và kết quả phân tích hàm lượng amino acid trong hạt của 20 giống đậu tương được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3 trình bày kết quả xác định sự có mặt của 17 loại amino acid và hàm lượng từng loại amino acid trong mỗi mẫu đậu tượng nghiên cứu; đồng thời cho thấy giữa 3 nhóm (kháng, trung gian và nhiễm bệnh gỉ sắt) không có sự sai khác rõ rệt về tổng hàm lượng của 17 amino acid. Hàm lượng amino acid tổng số dao động từ 31,81% - 39,54%, trong đó các mẫu như SL (31,81%), HG (32,65%) là có hàm lượng amino acid tổng số thấp nhất và các giống CNB (39,54%), VX92 (39,51%) có hàm lượng amino acid tổng số cao nhất.
Về thành phần của các loại amino acid, chúng tôi nhận thấy bằng việc áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC có đến 17 amino acid đã được xác định hàm lượng. Trong 17 amino acid có mặt, các amino acid như aspartic acid và glutamic acid thường có hàm lượng cao hơn so với các amino acid khác (aspartic acid có vai trò rất quan trọng trong sự tăng trưởng mô và cơ, sự tái tạo tế bào). Ngược lại, có các amino acid như cystein, histidine và methionine chiếm tỷ lệ thấp so với các loại amino acid còn lại. Aspartic acid và glutamic acid là các amino acid thay thế trong cơ thể.
Xét về giá trị dinh dưỡng của các giống đậu tương, chúng tôi nhận thấy mặc dù isoleucine, leucine, valine, tyrosine, lysine là các amino acid không thay thế nhưng hàm lượng của chúng là khá cao so với các amino acid thay thế, đặc biệt là lysine chiếm 4,41%.
Như vậy, bảng 3.3 cho thấy hàm lượng các amino acid giữa 3 nhóm là nhóm kháng (7 giống), nhóm trung gian (4 giống) và nhóm nhiễm bệnh (9 giống) là không có sựa sai khác rõ rệt.
Bảng 3.3. Thành phần của các amino acid của 20 giống đậu tương TT Axit amin DT2000 DT95 CBU8325 CNB PMTQ HSP2 HSP1 DT96 PHCB PS M103 DT12 DT84 VX93 VX92 HG SL VMK QHCB CV 1 Aspartic acid 4.70 4.72 4.84 4.41 4.48 4.14 4.15 5.12 63
3.3. Đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống đậu tương phản ứng khácnhau với bệnh gỉ sắt nhau với bệnh gỉ sắt
Để nghiên cứu sâu hơn về sự đa dạng sinh học, chúng tôi tiến hành đánh giá sự đa dạng di truyền ở mức độ phân tử DNA bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và SSR. Chúng tôi đã tách chiết được 50 mẫu DNA từ các giống đậu tương nghiên cứu, kết quả kiểm tra trên máy quang phổ ở bước sóng λ=260/280nm cho thấy các mẫu DNA có tỷ lệ OD 260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8-2,0. Kết quả này đã đáp ứng đủ yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch để có thể tiến hành các thí nghiệm phân tích sự đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA.
3.3.1. Phân tích tính đa hình DNA của các giống đậu tương bằng chỉthị phân tử RAPD thị phân tử RAPD
Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu sự đa dạng về mức độ phản ứng đối với bệnh gỉ sắt của các giống đậu tương đã khắc phục được những thiếu sót và hạn chế của phương pháp truyền thống trước đây [8]. Trong thí nghiệm này, 20 mồi RAPD (bảng 2.2) đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng trong hệ gen của 50 giống đậu tương trồng tại Việt Nam có phản ứng khác nhau đối với bệnh gỉ sắt nhằm cung cấp thông tin có giá trị cho công tác chọn tạo giống đậu tương.
Kết quả nhân bản và tỷ lệ xuất hiện các phân đoạn DNA
Phản ứng RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên được thực hiện và sản phẩm RAPD được điện di trên gel agarose 1,8%, nhuộm gel, chụp ảnh và phân tích tính đa hình DNA (Hình 3.2 và Hình 3.3).
Kết quả nhân bản các phân đoạn DNA bằng phản ứng RAPD từ hệ gen của 50 giống đậu tương cho thấy trong 20 mồi đã có 15 mồi biểu hiện tính đa hình. Với mỗi mồi ngẫu nhiên, số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản dao động từ 2-10 phân đoạn với kích thước từ 250bp-2000bp.
Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được từ hệ gen của 50 giống đậu tương là 3380 phân đoạn, trong đó mồi M14 có số đoạn DNA nhân bản là nhiều nhất (335 phân đoạn DNA) (hình 3.2) và ít nhất là mồi M8 (9 phân đoạn).
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M14
(M: Thang chuẩn DNA kích thước 1kb; 1-50: thứ tự tương ứng với tên của 50 giống đậu tương ở bảng 3.1)
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 kb 750 bp 500 bp 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 M 1 kb 750 bp 500 bp M 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 M 1 kb 750 bp 500 bp
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M18
(M: Thang chuẩn DNA kích thước 1 kb; 1-50: thứ tự tương ứng với tên của 50 giống đậu tương ở bảng 3.1)
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA đa hình của 20 mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR - RAPD là 113 đoạn. Trong đó có 73 phân đoạn đa hình (chiếm 64,6%) và 40 đoạn không có tính đa hình (chiếm 35,4%). Bảy mồi (M2, M3, M4, M9, M10, M13 và M18) có tính đa hình hoàn toàn (100%) và năm mồi (M5, M8, M12, M16 và M17) không cho tính đa hình (0%). Trong đó có 14/20 mồi có số phân đoạn đa hình trên 50%, mồi M14 có số phân đoạn đa hình bằng 50% (Hình 3.2), mồi M18 số phân đoạn đa hình là 100% (Hình 3.3).
Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình thể hiện ở giá trị PIC (bảng 3.4). Cụ thể, giá trị PIC của mồi M14 là 0,27 (tỷ lệ đa hình là 50%) và giá trị PIC của mồi M4 là 0,86 (đa hình cao nhất), trong đó 13/20 mồi cho giá trị PIC ≥ 0,5.
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn DNA khi so sánh giữa các giống khi phân tích với mỗi mồi RAPD. Chẳng hạn tại vị trí khoảng 0,25 - 0,5 kb tại giếng 3 (PI462312), và 30 (CV) đã xuất