Các chỉ thị hoá sinh có trong hầu hết các protein đa hình như isozyme và các protein dự trữ (stograge protein). Các isozyme có thể được phân tách theo trọng lượng, kích thước phân tử và các chất mang. Nhờ vậy, bằng kỹ thuật điện di trên gel tinh bột hoặc gel polyacrylamide, người ta có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, ví dụ như isozyme amylase, esterase… Các biến dạng này có thể cung cấp thông tin như là một loại chỉ thị đồng trội.
Thanh gel Mẫu protein
Chiều 1 IEF
Cân bằng mẫu -
+
Hình 1.4. Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE
Phương pháp phân tích isozyme tiết kiệm về mặt kinh tế, kỹ thuật và đơn giản hơn phân tích DNA. Tuy nhiên, isozyme là sản phẩm của gen, số lượng của chúng có hạn và chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển của cá thể. Vì vậy, loại chỉ thị này chỉ phản ánh chính xác một phần bản chất di truyền.
Hiện nay, các nghiên cứu về hệ gen (genomics) và hệ protein (proteomics) thực vật đang được quan tâm và ngày càng phát triển mạnh [40]. Kỹ thuật điện di 2 chiều (2-DE, two-dimensional electrophoresis) là kỹ thuật phân tách protein theo điểm đẳng điện (chiều thứ nhất) và theo trọng lượng phân tử (chiều thứ hai) (hình 1.4). Kỹ thuật này ngày càng trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi nhằm phân tách các phức hợp protein trong tế bào, mô và cơ thể [53], [55]. Phương pháp điện di hai chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là cách tiếp cận proteomics thường được sử dụng nhất [27], [35], [48], [50], [55]. TùyChiều 2 SDS-PAGE
thuộc vào kích thước gel và dải gradient pH sử dụng, điện di 2-DE có thể phân tách hàng ngàn protein (lên đến 5000 điểm protein), và có thể phát hiện vệt protein với lượng <1ng có mặt trong mẫu cùng một lúc, đồng thời so sánh mức độ biểu hiện khác nhau của chúng ở các mẫu phân tích để tìm các chỉ thị liên quan đến bệnh [84].
1.3.3. Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA
Chỉ thị phân tử DNA trong thời gian đầu chủ yếu là RFLP, dựa trên cơ sở mẫu dò đặc hiệu. Sau khi phát minh ra PCR, người ta phát triển tiếp các chỉ thị dựa trên phương pháp này như RAPD, AFLP, SSR, SNP, ... Bên cạnh đó, QTL (Quantitative Trait Loci) - bản đồ locus các tính trạng số lượng xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một số tính trạng số lượng cũng đang được các nhà khoa học quan tâm.
1.3.3.1. Chỉ thị RAPD
Kỹ thuật RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA để phân tích sự đa dạng di truyền, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và cộng sự [112]. RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự đang dạng di truyền của cùng một loài hoặc sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau [15], [25]. Mồi được sử dụng trong kỹ thuật RAPD là những sợi oligonucleotide gồm 10 cặp nucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được phân tách bằng cách điện di trên gel agarose. Hệ gen của các đối tượng khác nhau hoặc của hai loài sẽ cho sự khác nhau về những phân đoạn DNA, từ đó có thể so sánh sự đa dạng sinh học của các đối tương nghiên cứu.
Về nguyên tắc, kỹ thuật RAPD dựa trên phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction), bằng cách sử dụng những mồi ngắn có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các mồi. Mồi (primer) là những đoạn oligonucleotide ngắn, một mạch
(khoảng 10 nucleotide) được tổng hợp một cách ngẫu nhiên, có hàm lượng G+C cao (từ 60-70%) và không có đầu tự bổ sung. Các mồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA của hệ gen. Việc sử dụng chỉ thị RAPD trong việc nghiên cứu đa dạng và lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Thiết kế mồi; (ii) Chuẩn bị mẫu DNA và chạy PCR; (iii) kiểm tra sản phẩn nhân bản trên gel agarose; (iv) Phân tích kết quả bằng phần mềm chuyên dụng; (v) Xác định hệ số đồng dạng di truyền và thiết lập sơ đồ quan hệ di truyền của các đối tương nghiên cứu.
Các sinh vật cùng loài có kiểu gen hoàn toàn giống nhau thì các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước giống nhau, khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào trong phản ứng PCR-RAPD. Với các sinh vật khác loài, khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD, các đoạn DNA được khuếch đại sẽ có kích thước khác nhau. Để tìm sự khác biệt giữa các loài, người ta thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên với số lượng lớn.
Ứng dụng của chỉ thị RAPD
Kỹ thuật RAPD được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền các giống, phát hiện khả năng di truyền liên quan đến một tính trạng hoặc thiết lập bản đồ di truyền [43], [70], [96], [110]. Trong chương trình cải thiện giống, nhà chọn giống thường quan tâm đến những tính trạng mà nó biểu hiện bên ngoài (phynotype). Các tính trạng đó có thể là tính kháng sâu bệnh, tính chống chịu phèn, mặn hoặc stress… Nhưng nếu việc phân tích di truyền chỉ dựa trên kiểu hình thường kết quả dễ bị sai lệch, do kiểu hình là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường. Chính vì thế, nhà chọn giống cần phải biết tính trạng đó liên kết với kiểu gen như thế nào và phương pháp RAPD sẽ trợ giúp phát hiện được điều này.
Sử dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học của giống cây có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang, Nguyễn Hữu Hiệp và nhóm nghiên cứu đã sử dụng các mồi ngẫu nhiên, kết quả có 49 dấu phân tử được ghi nhận. Từ đó vẽ được giản đồ phả hệ của các giống cây này [5]. Barakat và cộng sự ứng dụng kỹ thuật RAPD đã phân tích và nhận dạng được các chỉ thị liên quan đến tính kháng bệnh đốm trắng ở lá ngô [32]. Trong khi đó, Paulo (2004) đã sử dụng 32 mồi để xác định mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô Brazil, kết quả thu được 225 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có 184 phân đoạn DNA thể hiện tính đa hình (chiếm 72,2%) [91]. Năm 2003, Jorge và cộng sự đã đánh giá sự tương đồng di truyền giữa 7 giống chè ở Hy Lạp nhờ kỹ thuật RAPD. Sử dụng 25 mồi ngẫu nhiên các tác giả đã nhân bản được 282 phân đoạn DNA, trong đó có 195 phân đoạn thể hiện tính đa hình [65]. Ngoài ra, Dey và cộng sự (2005) nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 38 dòng lúa thơm và 2 dòng đối chứng bằng kỹ thuật RAPD, kết quả khuếch đại được 44 phân đoạn DNA và có 41 phân đoạn thể hiện tính đa hình [43]. 1.3.3.2 Chỉ thị SSR
Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản) do Litt và Luty (1989) phát hiện lần đâu tiên trên đối tượng người [71]. Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng, ở người trình tự lặp lại đơn là TG với tần số lặp lại là 10-60 lần, chúng phân bố rải rác trong hệ gen tạo nên có khoảng 50.000 bản sao. Bằng kỹ thuật PCR, người ta đã phát hiện ra trình tự SSR ở gen tổng hợp actin của người và xác định được 12 alen trên 37 kiểu gen được nghiên cứu và nhận thấy các SSR này là những yếu tố trội di truyền theo quy luật của Mendel.
SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide nào đó. Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn là khá phổ biến. Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ 1 đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ
2 đến hàng ngàn lần hoặc nhiều hơn [20]. Các đoạn lặp lại hai, ba, bốn nucleotide như (CA)n, (AAT)n và (GATA)n phân bố rộng rãi trong hệ gen của các loài động và thực vật. Phương thức lặp lại được phân thành 3 loại chính: lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau); lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một số nucleotide khác); lặp lại phức tạp (sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau).
Việc sử dụng các chỉ thị SSR trong lập bản đồ di truyền của các locus đặc trưng bao gồm các bước sau: (i) Phân lập đoạn SSR từ thư viện hệ gen; (ii) Xác định trình tự của vùng có SSR; (iii) Xác định các cặp mồi đặc trưng là các trình tự DNA bảo thủ giới hạn hai đầu của đoạn SSR; (iv) Nhân vùng gen tương ứng bằng PCR sử dụng các mồi đặc trưng; (v) Phân tích kích thước của sản phẩm PCR nhằm xác định được sự có mặt của các alen SSR.
Phản ứng PCR - SSR với mồi được thiết kế dựa trên hệ gen của từng loài, nên chỉ thị SSR cho kết quả đa hình cao hơn là các chỉ thị phân tử khác. Kỹ thuật này chỉ đòi hỏi một lượng nhỏ DNA mẫu nhưng lại cho phép phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể trong cùng một giống. Phản ứng không mất nhiều thời gian. Hầu hết các locus SSR ở thực vật có sự đa hình cao hơn các chỉ thị phân tử khác và cho kết quả nhanh và đáng tin cậy hơn chỉ thị RAPD. Chỉ thị SSR với các locus đặc trưng, đa alen và cung cấp nhiều thông tin nên chúng hết sức có ích trong việc thay đổi trình tự hiếm [67]. Đây chính là những ưu điểm chính của kỹ thuật SSR. Nói chung, chỉ thị SSR tương đối đơn giản hơn so với chỉ thị RFLP hay AFLP. Vì vậy, chỉ thị này được quan tâm hơn trong ứng dụng vào chọn giống thực vật [95].
Hạn chế của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của và công sức trong việc thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ngoài ra, việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu đòi hỏi phải tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA bộ gen chứa SSR [74]. Vì vậy, số lượng các mồi chưa được phát triển ở nhiều loại thực vật.
Ứng dụng của kỹ thuật SSR
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, SSR được áp dụng để nghiên cứu đa dạng trên cả đối tượng động vật và thực vật vì nó cho độ đa hình cao và đáng tin cậy. Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã được xác định trên một số loài cây như lạc, mơ, lúa mì [32], [75] và đang phát triển ở các giống cây trồng khác như đậu tương [111]. Trong việc nghiên cứu tạo giống mới, chỉ thị SSR liên quan đến một số tính trạng đã được xác định như chọn giống nhờ chỉ thị (marker-assisted selection). Các chỉ thị SSR đã được dùng để chọn dòng kháng bệnh khảm do virus ở cây đậu tương [29], chọn các dòng lúa có năng suất cao và hàm lượng protein dự trữ cao hoặc để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống cây trồng ở một số đối tượng như lúa, mía, đậu tương, cà chua hoặc xây dựng bản đồ di truyền liên kết tính trạng ở cà chua và lúa và xác định giới tính thực vật trên đối tượng đu đủ .
1.3.3.3. Các chỉ thị RFLP và AFLP
Các chỉ thị phân tử như RFLP (Restriction Fragment length
Polymorphism) và AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cũng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa hình DNA.
Nguyên lý của kỹ thuật RFLP dựa trên cơ sở sử dụng mẫu dò đặc hiệu (trình tự DNA đã biết) để xác định sự thay đổi trong locus đặc hiệu đó ở bộ gen của các cá thể cần nghiên cứu. Kỹ thuật RFLP được tiến hành như sau: các endonuclease cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA bộ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng loạt các phân đoạn nhỏ có kích thước khác nhau. Số lượng các phân đoạn này phụ thuộc vào điểm nhận biết trong bộ gen. Sản phẩm của quá trình cắt sẽ được điện di, sau đó được chuyển nguyên vị và cố định trên màng lai. Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn sẽ được phát hiện bằng sự kết hợp giữa mẫu dò đã được đánh dấu (bằng phóng xạ hoặc bằng phương pháp hoá học) và các đoạn DNA của mẫu cần phân tích (được tạo ra từ cùng một locus theo nguyên tắc bổ sung). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong khi đó, AFLP là một kỹ thuật đánh dấu phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân các đoạn được cắt hạn chế bởi enzyme giới hạn. Cũng như các chỉ thị phân tử khác, AFLP khám phá hiện tượng đa hình qua sự khác nhau về độ dài của các đoạn DNA được nhân. Kỹ thuật này gồm 3 bước: cắt DNA bộ gen bằng enzyme giới hạn và gắn các đoạn oligonucleotide tiếp hợp (adapter), nhân một cách chọn lọc các đoạn giới hạn và phân tích trên gel các đoạn DNA được nhân lên.
Chỉ thị AFLP ít phức tạp hơn RFLP, với ưu điểm là độ đa hình cao nhận dạng tới cá thể, thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị liên kết rất chặt và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền [103].
Các công trình nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử ở đậu tương sử dụng chỉ thị RAPD đôi khi cho kết quả tính đa hình thấp. Vì thế, gần đây việc thiết kế mồi SSR chuyên dụng cho đậu tương đã và đang được một số Viện nghiên cứu trên thế giới tiến hành [62]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu tính chịu nóng, chịu hạn ở thực vật nói chung và đậu tương nói riêng còn rất hạn chế, đặc biệt là trên đối tượng đậu tương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt. Tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực và cây thực phẩm Việt Nam, hàng trăm mẫu giống đậu tương nhập nội và giống đậu tương địa phương đã được đánh giá về khả năng chịu nóng, chịu hạn, kháng sâu bệnh. Việc chọn tạo giống chủ yếu dựa trên những phương pháp thủ công truyền thống trên cơ sở phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý, nông sinh học mà chưa đi sâu vào chọn lọc dựa trên những đặc điểm di truyền phân tử. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương là rất cần thiết.
1.3.3.4. Bản đồ QTL
Bản đồ các locus kiểm soát tính trạng số lượng QTL (Quantitative Trait Loci) xác định mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng số
lượng đang được quan tâm. Từ bản đồ QTL ta có thể xác định được những vùng trên NST có liên quan đến một tính trạng hay không. Các bước để lập bản đồ QTL như: (i) xác định cặp lai có tính trạng đối kháng nhau; (ii) lai và tạo quần thể cho lập bản đồ (300-600 cá thể); (iii) theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể; (iv) xử lý thống kê và lập bản đồ.
Lập bản đồ QTL nhằm xác định vị trí gen, hiệu quả và hoạt động của các locus liên quan trong mối tương tác giữa các sản phẩm của gen và tương tác QTL với môi trường, từ đó chọn lọc được các dòng với tính trạng mong muốn nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Selection). Năm 2002, các nghiên cứu lập bản đồ QTL liên kết với tính trạng qui định khối lượng [61] hoặc tính chịu hạn ở đậu xanh [103] đã được mô tả.
1.4. Các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt ở cây đậu tương
Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về gỉ sắt [32], [52], [77], [81]. Ở Đài Loan, bệnh gỉ sắt gây thiệt hại nghiêm trọng đến cây đậu tương và làm hạn chế năng xuất đậu tương vụ xuân. Trung tâm Rau màu Châu Á (AVRCD) của Đài Loan đã tiến hành so sánh 1080 giống, kết quả có 9 mẫu giống kháng bệnh trung bình, trong đó có 4 mẫu giống có nguồn gốc từ Trung Quốc, 3 giống có nguồn gốc từ Nhật Bản, 1 giống có nguồn gốc từ Triều Tiên. Giống Tainung 4 có sức kháng bệnh nhiều hơn các giống khác trong điều kiện đồng ruộng, số lượng vết bệnh ít hơn [6]. Ở Mỹ, Bộ Nông nghiệp Mỹ kết hợp Phòng thí nghiệm Nghiên cứu bệnh thực vật và AVRCD đã khởi động một dự án hợp tác nghiên cứu dịch tễ học của bệnh gỉ sắt đậu tương năm 1978. Dự án này kéo dài đến năm 1982 và các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt được tiếp tục tiến hành cho đến năm 1992. Ở Thái Lan, chương trình quốc gia của Thái Lan đã và đang tiến hành các nghiên cứu về bệnh gỉ sắt đậu tương với các mục tiêu lai giống chủ động kéo dài hơn 10 năm qua [88]. Ở Indonesia, phần lớn các giống đậu tương đều bị nhiễm bệnh cho nên bệnh gỉ sắt được xem là loại bệnh