Tách chiết DNA plasmid
Plasmid được tách chiết nhằm xác định vector nào mang đoạn chèn và vector nào không mang đoạn chèn. Phương pháp tách plasmid được trình bày ở mục 2.2.7.
Để tách chiết DNA plasmid, một số khuẩn lạc được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp ở 37oC từ 12- 14h. Phương pháp tách chiết plasmid gồm 3 bước chính: thu nhận và phân giải tế bào, làm sạch plasmid và kết tủa DNA. Dung dịch I (sol I) có tác dụng rửa sạch tế bào, dung dịch II (sol II) có chứa SDS và NaOH có tác dụng phá màng tế bào và ức chế hoạt động của nuclease, không cho chúng phân giải DNA do Mg2+ (một nhân tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease) bị liên kết với EDTA, khi cho tiếp dung dịch III (sol III) có chứa axetate và axetic acid thì pH môi trường chuyển thành acid yếu gần với điểm đẳng điện của DNA, vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và dễ dàng tách được nhờ ly tâm. Do trong tế bào vi khuẩn có chứa hai dạng DNA là DNA nhiễm sắc thể và DNA plasmid nên việc tách và tinh sạch DNA plasmid là rất quan trọng, DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dụng dịch I, II, III. Do DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn và liên kết chặt chẽ với protein nên khoảng thời gian ngắn giữa các lần thêm dung dịch không kịp thoát ra ngoài.
DNA plasmid thu được sau khi tách chiết từ tế bào vi khuẩn thường tồn tại ở 3 dạng: dạng siêu xoắn được tạo ra do liên kết hydro giữa một số phần của phân tử DNA plasmid hay do lực hút tĩnh điện giữa các phần của phân tử với nhau, dạng vòng mở do bị đứt gãy một mạch đơn của chuỗi DNA mạch kép và dạng mạch
thẳng khi cả hai mạch DNA dều bị đứt gãy. Dạng siêu xoắn có cấu trúc không gian gọn nên khi điện di chúng thường chạy nhanh nhất, tiếp đến là mạch thẳng và cuối cùng là mạch vòng. DNA sau đó được hoà tan trong dung dịch RNase 0,01mg/ml nhằm loại bỏ RNA và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Theo lý thuyết khi một DNA plasmid mang gen ngoại lai, chúng sẽ có kích thước bằng tổng kích thước của plasmid và kích thước của gen ngoại lai. Do vậy trong điện di đồ, chúng sẽ chạy chậm hơn (thấp hơn) so với đối chứng âm (các plasmid chưa mở vòng), dựa vào đó chúng ta có thể kết luận sơ bộ được những plasmid này có kích thước lớn hơn và có thể chúng mang gen ngoại lai.
Hình 3.3. Chọn dòng pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA)
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
ĐC: Đối chứng âm
1- 7: DNA plasmid của các dòng pGEX6p1
Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các đường chạy đều xuất hiện 2 băng chạy trước rõ nét hơn, điều đó chứng tỏ lượng DNA plasmid của chúng tôi thu được tồn tại ở dạng siêu xoắn nhiều hơn dạng thẳng. Hình 3.3 cho thấy, đối với các dòng mang vector pGEX6p1, dòng 1 và 3 (ký hiệu pGEX/htPA p1 và pGEX/htPA p3) là hai dòng có kích thước lớn hơn các dòng khác và lớn hơn so với đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA.
Đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có thể mang cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).
Hình 3.4. Chọn dòng pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA)
ĐC: Đối chứng âm (vector pET21a(+) không mang h-tPA) 1- 5: DNA plasmid của các dòng pET21a(+)
Tương tự, đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có kích thước lớn hơn các dòng khác và đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Để chứng minh chính xác xem đoạn xen vào plasmid có phải là đoạn gen mã hoá h- tPA hay không, chúng tôi đã tiếp tục kiểm tra bằng enzyme hạn chế, tiến hành PCR và giải trình tự.
Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng xử lý enzyme hạn chế
Hai cặp enzyme NdeI/XhoI và BamHI/XhoI đã được sử dụng để tạo đầu bổ
sung cho vector và đoạn chèn nên để kiểm tra, chúng tôi cũng sử dụng hai cặp enzyme này nhằm kiểm tra các dòng được chọn có mang đoạn chèn hay không. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm xử lý enzyme của plasmid tái tổ hợp bao gồm hai đoạn gen, một đoạn có kích thước tương ứng với vector gốc (vector mở vòng) và một đoạn có kích thước tương ứng với đoạn chèn (cDNA mã hóa h-tPA). Thành phần và quy trình phản ứng được tiến hành như trình bày ở mục 2.2.4. Các sản phẩm xử lý enzyme được điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.5. Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, sau khi xử lý các vector tái tổ hợp bằng hai cặp enzyme tương ứng, chúng tôi thu được hai băng có kích thước khác nhau; đối
M: Marker 1kb 1: pGEX/htPA p1 2: pGEX/htPA p3
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
với vector pGEX6p1, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 5kb (tương ứng với kích thước của vector pGEX6p1 khi xử lý bằng hai enzyme BamHI/
XhoI) và một băng có kích thước 1,7kb (tương ứng với kích thước cDNA mã hoá h-
tPA). Đối với vector pET21a(+), chúng tôi cũng thu được một băng có kích thước
khoảng 5,5kb (tương ứng với kích thước vector pET21a(+)) và một băng có kích
thước khoảng 1,7kb (tương ứng với kích thước cDNA mã hoá h-tPA). Như vậy,
chúng tôi sơ bộ kết luận là đã chọn được một số dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn
gen phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR h-tPA.
Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR
Để khẳng định lại các dòng plasmid tái tổ hợp đã được chọn có mang đúng đoạn gen mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR với việc sử dụng các plasmid được chọn làm khuôn để nhân đoạn h-tPA với các cặp mồi đặc hiệu. DNA mẫu để chạy PCR là pGEX/htPA p3 và pET/htPA p1. Kết quả kiểm tra các vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật PCR được trình bày trên hình 3.6.
Hình 3.6. Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR
M: Marker 1kb
1: PCR sử dụng khuôn là pET/htPA p1 2: PCR sử dụng khuôn là pGEX/htPA p3
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của các dòng mang kiểm tra này đều xuất hiện băng với kích thước khoảng 1,7 kb, đúng với kích thước cDNA mã hóa cho h-tPA. Như vậy, các dòng được chọn làm khuôn trong thí nghiệm PCR đều có mang cDNA mã hóa h-tPA. Các dòng này đã được chúng tôi tinh sạch phục vụ cho xác định trình tự.
3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hoá h-tPA
Mặc dù đã được xác định trình tự trong vector tạo dòng pUC18, tuy nhiên, khi nhân lại cDNA này bằng enzyme Taq DNA polymerase có khả năng phát sinh các điểm đột biến. Vì vậy, sau khi chọn được các dòng mang cDNA mã hoá h-tPA, trước khi tiến hành biểu hiện, chúng tôi đã tinh sạch và một lần nữa xác định trình tự cả hai chiều đoạn cDNA bằng hai cặp mồi: cặp mồi T7 đối với vector pET21a(+) và cặp mồi PEXF/PEXR đối với vector pGEX6p1 trên máy xác định trình tự tự động. Trình tự DNA sau đó được xử lý trên các phần mềm: BioEdit, Sequencing analysis 7.0. Sau khi sử lý số liệu, chúng tôi đã thu được đoạn gen có kích thước khoảng 1700bp. Phổ trình tự của các dòng plasmid đều rõ ràng, không có tín hiệu nhiễu. Kết quả phân tích và so sánh với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế như sau:
10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal
pET21a(+) ................................................ MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal
pGEX6p1 ................................................ MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal
70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 tcgcccagccaggaaatccatgcccgattcagaagaggagccagatcttaccaagtgatc SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerTyrGlnValIle
pET21a(+) ............................. SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerTyrGlnValIle
pGEX6p1 ............................. SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerTyrGlnValIle
130 140 150 160 170 180
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 tgcagagatgaaaaaacgcagatgatataccagcaacatcagtcatggctgcgccctgtg CysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgProVal
pET21a(+) .................................... CysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgProVal
pGEX6p1 .................................... CysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgProVal
190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ctcagaagcaaccgggtggaatattgctggtgcaacagtggcagggcacagtgccactca LeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSer
pET21a(+) .................................. LeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSer
pGEX6p1 .................................. LeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSer
250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 gtgcctgtcaaaagttgcagcgagccaaggtgtttcaacgggggcacctgccagcaggcc ValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGlnAla
pET21a(+) ............................ ValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGlnAla
pGEX6p1 ............................ ValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGlnAla
310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ctgtacttctcagatttcgtgtgccagtgccccgaaggatttgctgggaagtgctgtgaa LeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCysGlu
pET21a(+) ............................................... LeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCysGlu
pGEX6p1 ............................................... LeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCysGlu
370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 atagataccagggccacgtgctacgaggaccagggcatcagctacaggggcacgtggagc IleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSer
pET21a(+) ............................. IleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSer
pGEX6p1 ............................. IleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSer
430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 acagcggagagtggcgccgagtgcaccaactggaacagcagcgcgttggcccagaagccc ThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysPro
pET21a(+) .................... ThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysPro
pGEX6p1 .................... ThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysPro
490 500 510 520 530 540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 tacagcgggcggaggccagacgccatcaggctgggcctggggaaccacaactactgcaga TyrSerGlyArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCysArg
pET21a(+) ....T....................... TyrSerGlyArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCysArg
pGEX6p1 ....T....................... TyrSerGlyArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCysArg
550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 aacccagatcgagactcaaagccctggtgctacgtctttaaggcggggaagtacagctca AsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSerSer
pET21a(+) .................................... AsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSerSer
pGEX6p1 .................................... AsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSerSer
610 620 630 640 650 660
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 gagttctgcagcacccctgcctgctctgagggaaacagtgactgctactttgggaatggg GluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGly
pET21a(+) ........................................... GluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGly
pGEX6p1 ........................................... GluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGly
670 680 690 700 710 720
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 tcagcctaccgtggcacgcacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaat SerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn
pET21a(+) ............................................ SerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn
pGEX6p1 ............................................ SerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn
730 740 750 760 770 780
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 tccatgatcctgataggcaaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggc SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGly
pET21a(+) ................................ SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGly
pGEX6p1 ................................
SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGly
790 800 810 820 830 840
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ctgggcaaacataattactgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtg LeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisVal
pET21a(+) ....................................... LeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisVal
pGEX6p1 ....................................... LeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisVal
850 860 870 880 890 900
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ctgaagaaccgcaggctgacgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggc LeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGly
pET21a(+) ........................................... LeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGly
pGEX6p1 ........................................... LeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGly
910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ctgagacagtacagccagcctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcc LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla
pET21a(+) .................................... LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla
pGEX6p1 .................................... LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla
970 980 990 1000 1010 1020
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 tcccacccctggcaggctgccatctttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttc SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPhe
pET21a(+) ............................ SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPhe
pGEX6p1 ............................ SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPhe
1030 1040 1050 1060 1070 1080
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ctgtgcgggggcatactcatcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccag LeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGln
pET21a(+) ................................................ LeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGln
pGEX6p1 ................................................ LeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGln
1090 1100 1110 1120 1130 1140
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 gagaggtttccgccccaccacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccct
GluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValPro
pET21a(+) ...................................
GluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValPro
pGEX6p1 ...................................
GluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValPro
1150 1160 1170 1180 1190 1200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ggcgaggaggagcagaaatttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgat GlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp
pET21a(+) ...................................... GlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp
pGEX6p1 ......................................
GlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp
1210 1220 1230 1240 1250 1260
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 gacacttacgacaatgacattgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcc AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAla
pET21a(+) .................................................. AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAla
pGEX6p1 .................................................. AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAla
1270 1280 1290 1300 1310 1320
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 caggagagcagcgtggtccgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggac GlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAsp
pET21a(+) ............................... GlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAsp
pGEX6p1 ............................... GlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAsp
1330 1340 1350 1360 1370 1380
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 tggacggagtgtgagctctccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcg TrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSer
pET21a(+) ........................................... TrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSer
pGEX6p1 ........................................... TrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSer
1390 1400 1410 1420 1430 1440
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 gagcggctgaaggaggctcatgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacat GluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis
pET21a(+) ................................... GluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis
pGEX6p1 ................................... GluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis
1450 1460 1470 1480 1490 1500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ttacttaacagaacagtcaccgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcggg LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGly
pET21a(+) ............................... LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGly
pGEX6p1 ............................... LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGly
1510 1520 1530 1540 1550 1560
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 ccccaggcaaacttgcacgacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctg ProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeu
pET21a(+) ............................ ProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeu
pGEX6p1 ............................ ProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeu
1570 1580 1590 1600 1610 1620
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| NM_000930 aacgatggccgcatgactttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaag AsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLys
pET21a(+) ........................................... AsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLys
pGEX6p1 ........................................... AsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLys
1630 1640 1650 1660 1670 1680
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 gatgtcccgggtgtgtacaccaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatg
AspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet
pET21a(+) ............................................ AspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet
pGEX6p1 ............................................ AspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet
....|.... NM_000930 cgaccgtga ArgProEnd
pET21a(+) ...--- ArgPro
pGEX6p1 ...... ArgProEnd
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA và pET21a(+)/h-tPA với NM_000930
Từ kết quả so sánh trên, chúng tôi nhận thấy trình tự cDNA mã hóa h-tPA được tạo dòng trong hai vector biểu hiện hoàn toàn không thay đổi so với trình tự cDNA đã xác định được trong vector tạo dòng pUC18. So với NM_000930, trình tự cDNA của chúng tôi không có sự thay đổi nào đáng kể, chỉ có một sai khác nằm ở vị trí 499 của cDNA mã hóa h-tPA. Ở trình tự NM_000930, vị trí 499 nucleotitde này là C được thay thế bằng nucleotide T trong trình tự chúng tôi đang nghiên cứu biểu hiện. Tuy nhiên trình tự này không làm thay đổi trình tự acid amin, vì vậy không ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng của protein. Ở vector pET21a(+), không có trình tự kết thúc do chúng tôi thiết kế mồi PCR nhằm gắn đuôi His vào giúp quá trình tinh sạch protein h-tPA sau này được dễ hơn.
3.2. Biểu hiện gen
3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp
Trong nghiên cứu này, sau khi thu được các dòng plasmid mang gen cDNA mã hoá h-tPA, để biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi đã tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp (pET21a(+) và pGEX6p1) mang gen mã hoá h-tPA vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) plysS. Các dòng tế bào này sau đó được cấy
chuyển và tiếp tục nuôi lắc 200 v/p trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp ở 37oC cho tới khi OD= 0,6 thì tiến hành cảm ứng IPTG 0,1mM. Đối với vector biểu hiện pGEX6p1, theo tính toán lý thuyết, protein h-tPA tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 95kDa (bằng tổng khối lượng của protein h-tPA (70 kDa) và đoạn GST (26,4 kDa)); còn đối với vector biểu hiện pET21a(+), khối lượng phân tử protein tái tổ hợp thu được khoảng 72kDa.
Sau mỗi giờ từ khi cảm ứng IPTG chúng tôi đã tiến hành thu 1ml dịch tế bào nhằm kiểm tra độ biểu hiện của tế bào. Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi thu được dịch tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến hành điện di protein trên gel polyacrylamide 10%.
3.2.2. Kiểm tra protein bằng phƣơng pháp điện di trên SDS-PAGE
Đối với vector biểu hiện pGEX6p1 mang h-tPA, kết quả phân tích SDS- PAGE cho thấy các mẫu thí nghiệm đã xuất hiện một băng protein mới có kích thước khoảng 95kDa so với các mẫu đối chứng. Đây rất có thể là dạng protein dung hợp giữa h-tPA (72kDa) với đuôi GST (26,4kDa) của vector pGEX6p1.
Mẫu đối chứng âm chúng tôi sử dụng là dịch phá màng của tế bào BL21 có chứa vector pGEX6p1 gốc (giếng 5) và dịch phá màng của E.coli BL21 không
mang vector (giếng 7) có cảm ứng IPTG. Các mẫu đối chứng âm này cũng xuất hiện băng nhưng kích thước nhỏ và không rõ nét. Có thể ở những mẫu này, tế bào chủ có tổng hợp một số protein có cùng kích thước nhưng hàm lượng thấp. Ở giếng 5 xuất hiện băng đậm có kích thước 26,4kDa, đây là băng GST đã được tổng hợp tuy nhiên do plasmid không mang gen cDNA mã hóa h-tPA nên trong quá trình tổng hợp protein, h-tPA không được tổng hợp.
Hình 3.8. Điện di kiểm tra protein h-tPA trong pGEX/h-tPA p3
M: Marker
1, 2, 3, 4: Mẫu thu được sau 0h, 1h, 2h, 3h cảm ứng IPTG 5: Dòng tế bào mang vector pGEX6p1
6: Mẫu thu được sau 3h cảm ứng IPTG 7: Dòng tế bào không mang vector
Để xác định được thời điểm tại đó lượng protein được tổng hợp là cao nhất, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trong 3h sau khi cảm ứng. Sau khoảng thời gian 0h, 1h, 2h, 3h chúng tôi đã tiến hành thu mẫu. Kết quả cho thấy kích thước và độ
