Trong nghiên cứu này, sau khi thu được các dòng plasmid mang gen cDNA mã hoá h-tPA, để biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi đã tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp (pET21a(+) và pGEX6p1) mang gen mã hoá h-tPA vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) plysS. Các dòng tế bào này sau đó được cấy
chuyển và tiếp tục nuôi lắc 200 v/p trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp ở 37oC cho tới khi OD= 0,6 thì tiến hành cảm ứng IPTG 0,1mM. Đối với vector biểu hiện pGEX6p1, theo tính toán lý thuyết, protein h-tPA tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 95kDa (bằng tổng khối lượng của protein h-tPA (70 kDa) và đoạn GST (26,4 kDa)); còn đối với vector biểu hiện pET21a(+), khối lượng phân tử protein tái tổ hợp thu được khoảng 72kDa.
Sau mỗi giờ từ khi cảm ứng IPTG chúng tôi đã tiến hành thu 1ml dịch tế bào nhằm kiểm tra độ biểu hiện của tế bào. Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi thu được dịch tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến hành điện di protein trên gel polyacrylamide 10%.
3.2.2. Kiểm tra protein bằng phƣơng pháp điện di trên SDS-PAGE
Đối với vector biểu hiện pGEX6p1 mang h-tPA, kết quả phân tích SDS- PAGE cho thấy các mẫu thí nghiệm đã xuất hiện một băng protein mới có kích thước khoảng 95kDa so với các mẫu đối chứng. Đây rất có thể là dạng protein dung hợp giữa h-tPA (72kDa) với đuôi GST (26,4kDa) của vector pGEX6p1.
Mẫu đối chứng âm chúng tôi sử dụng là dịch phá màng của tế bào BL21 có chứa vector pGEX6p1 gốc (giếng 5) và dịch phá màng của E.coli BL21 không
mang vector (giếng 7) có cảm ứng IPTG. Các mẫu đối chứng âm này cũng xuất hiện băng nhưng kích thước nhỏ và không rõ nét. Có thể ở những mẫu này, tế bào chủ có tổng hợp một số protein có cùng kích thước nhưng hàm lượng thấp. Ở giếng 5 xuất hiện băng đậm có kích thước 26,4kDa, đây là băng GST đã được tổng hợp tuy nhiên do plasmid không mang gen cDNA mã hóa h-tPA nên trong quá trình tổng hợp protein, h-tPA không được tổng hợp.
Hình 3.8. Điện di kiểm tra protein h-tPA trong pGEX/h-tPA p3
M: Marker
1, 2, 3, 4: Mẫu thu được sau 0h, 1h, 2h, 3h cảm ứng IPTG 5: Dòng tế bào mang vector pGEX6p1
6: Mẫu thu được sau 3h cảm ứng IPTG 7: Dòng tế bào không mang vector
Để xác định được thời điểm tại đó lượng protein được tổng hợp là cao nhất, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trong 3h sau khi cảm ứng. Sau khoảng thời gian 0h, 1h, 2h, 3h chúng tôi đã tiến hành thu mẫu. Kết quả cho thấy kích thước và độ
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
đậm của băng này tăng theo thời gian sau khi cảm ứng IPTG và đậm nhất tại thời điểm 3h sau cảm ứng.
Kết quả này cho thấy dòng tế bào E.coli BL21 có mang plasmid pGEX6p1
tái tổ hợp có khả năng tổng hợp protein dung hợp GST-htPA. Tuy nhiên hàm lượng protein tái tổ hợp còn thấp so với tổng lượng protein được tổng hợp.
Song song với thí nghiệm biểu hiện h-tPA trong vector pGEX6p1, chúng tôi cũng tiến hành biểu hiện protein h-tPA trong vector pET21a(+) trên tế bào chủ
E.coli BL21.
Sau khi thu được dịch protein, chúng tôi đã điện di trên gel polyacrylamide 10% với thang protein chuẩn và các đối chứng âm. Các đối chứng âm ở đây cũng là dịch phá màng tế bào E. coli BL21 không mang vector và có mang vector pET21a(+) đều được cảm ứng IPTG.
Hình 3.9. Điện di protein h-tPA trong pET21/h-tPA p1
M: Marker
1: Dòng tế bào BL21
2: Dòng tế bào BL21 mang vector pET21a(+) gốc
3, 4, 5, 6: Mẫu thu được sau 0h, 1h, 2h, 3h cảm ứng IPTG Sau khi thu được dịch protein, chúng tôi đã điện di trên gel polyacrylamide 10% với thang protein chuẩn và các đối chứng âm. Các đối chứng âm ở đây cũng là
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
dịch phá màng tế bào E. coli BL21 không mang vector và có mang vector pET21a(+) đều được cảm ứng IPTG.
Kết quả điện di cho thấy không có sự khác biệt nhiều về số lượng và độ đậm nhạt băng giữa các dòng E.coli BL21 mang vector pET21a(+)/h-tPAvới các đối
chứng âm (giếng 1 và giếng 2).
Ở vị trí 72kDa có xuất hiện băng nhưng giữa các mẫu điện di là giống nhau. Nếu h-tPA không được biểu hiện thì băng 72kDa này là protein có cùng khối lượng của tế bào E.coli được tổng hợp. Nếu gen h-tPA được tổng hợp thì hàm lượng
protein được tổng hợp là rất thấp so với tổng lượng protein của tế bào chủ.
Để có những kết luận chính xác về quá trình biểu hiện của cDNA mã hóa h-
tPA, cần có những nghiên cứu khác như: lai Western Blot, hay kỹ thuật Elisa...
nhằm khẳng định protein h-tPA được tổng hợp. Mặt khác, các điều kiện thí nghiệm
khác cũng cần được nghiên cứu tối ưu để quá trình biểu hiện cho lượng protein h-
tPA là lớn nhất và tiến tới ứng dụng quy trình biểu hiện.
Cũng cần nhấn mạnh rằng, mặc dù hệ thống biểu hiện gen của sinh vật bậc cao trên đối tượng vi khuẩn E. coli bên cạnh nhiều ưu điểm như: môi trường nuôi cấy rẻ; dễ điều khiển quá trình biểu hiện; hàm lượng protein thu được lớn (đến 30% tổng protein tế bào).... còn tồn tại một vài nhược điểm. Đây là một quá trình phức tạp và khó thực hiện do hệ thống này chỉ biểu hiện tốt đối với protein có kích thước nhỏ hơn 80 acid amin, đối với các protein có kích thước lớn thì hệ thống biểu hiện
E.coli có thể tổng hợp được protein nhưng protein này có thể không cuộn xoắn; bộ
ba mã hóa ở E.coli có sự khác biệt nhiều với bộ ba mã hóa ở sinh vật bậc cao; các quá trình cải biến sau dịch mã thường không có; khả năng biểu hiện một protein đơn lẻ không tốt... Đối với h-tPA, đã có nhiều công trình công bố biểu hiện được trên E. coli nhưng hàm lượng protein thu được chưa cao. Vì vậy, việc nghiên cứu biểu hiện trên các đối tượng khác như nấm men, tế bào côn trùng, tế bào động vật cũng được quan tâm ở nhiều phòng thí nghiệm.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Đã tạo được hai vector biểu hiện pGEX6p1 và pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA có kích thước khoảng 1,7kb.
2. Đã xác định trình tự nucleotide của cDNA mã hóa h-tPA. So sánh trình tự nucleotide của cDNA mã hóa h-tPA với trình tự gen trên Ngân hàng Gen Quốc tế, mã số NM_000930 cho thấy độ tương đồng đạt 99%. So với NM_000930, trình tự cDNA nghiên cứu không có sự thay đổi nào đáng kể, chỉ có một sai khác nằm ở vị trí 499 của cDNA mã hóa h-tPA. Ở trình tự NM_000930, vị trí 499 nucleotitde này là C được thay thế bằng nucleotide T. Tuy nhiên, sự khác biệt này không làm thay đổi trình tự acid amin, vì vậy không ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng của protein.
3. Đã tiến hành biểu hiện cDNA mã hóa h-tPA trên hai vector pGEX6p1 và pET21a(+) và thu được protein h-tPA khi biểu hiện trong vector pGEX6p1.
Đề nghị
- Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa h-tPA trong vector pET21a(+) trên vi khuẩn E.coli chủng BL21.
- Tối ưu hoá quá trình biểu hiện đối với cDNA mã hóa h-tPA trong pGEX6p1 nhằm thu được hàm lượng protein lớn nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt1.
Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), “Nghiên cứu và phát triển sản xuất vaccine ăn được trong thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 133- 142.2.
Nguyễn Đình Cường, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Lương Thị Thu Hường, Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải (2003), “Biểu hiện gen mã hóa protein bất hoạt ribosome của cây mướp đắng ở vi khuẩn Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,1(4), tr. 451- 460.
3.
Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ hợp”, Y học Việt Nam, 284(5), tr. 26- 30.4.
Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), “Biểu hiện gen interleukin- 2 của người rh-LL2LL bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc cysteine 125 trong Escherichia coli”, Tạp chíCông nghệ Sinh học, 3(2), tr. 149- 154.
5.
Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng Quốc Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu hiện và xác định interleukin- 2 của người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 143- 148.6.
Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã hóa interleukin- 2 của người”, Y học Việt Nam, 310(5), tr. 26- 30.7.
Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia coli”,Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 155- 160.
8.
Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thúy, Nguyễn Hữu Lộc (1992), “Thuốc, biệt dược vàTiếng Anh
9.
Axelsson F. (1995), “Plasminogen”, Product monograph.10.
Becker C., Nong V.H., Bäumlein H., Le T.X., Farouk A., Will H., Bassüner R. (1993), “Synthesis and accumulation of human tissue-type plasminogen activator (h-tPA) in transgenic tobaco seeds”, Seed storage compounds 35, pp. 326- 331.11.
Berg D.T., Burck P.J., Grinnell B.W. (1993), “Kringle glycosylation in a modified human tissue plasminogen activator improves functional properties”, Blood 81(5), pp. 1312- 1322.12.
Bhopale G.M., Nanda R.K. (2005), “Recombinant DNA expression products for human therapeutic use”, Curr. Scie. 89(4), pp. 614- 622.13.
Booyse F.M., Scheinbuks J., Lin P.H., Traylor M., Bruce R. (1988), “Isolation and interrelationships of the multiple molecular tissue-type and urokinase- type plasminogen activator forms produced by cultured human umbilical vein endothelial cells”, J. Biol. Chem. 263(29), pp. 15129- 15138.14.
Bulleid N.J., Bassel- Duby R.S., Freedman R.B., Sambrook J.F., Gething M.H. (1992), “Cell-free synthesis of enzymically active tissue-type plasminogen activator”, Biochem. J. 286, pp. 275- 280.15.
Burck P.J., Berg D.H., Warrick M.W., Berg D.T., Walls J.D., Jaskunas S.R., Crisel R.M., Weigel B., Vlahos C.J., McClure D.B., Grinnell B.W. (1990), “Characterization of a modified human tissue plasminogen activator comprising a kringle-2 and a protease domain”, J. Biol. Chem. 265(9), pp. 5170- 5177.16.
Carlie V.C., Veerman H., Pannekoek H. (1989), “Identification of the domains of tissue-type plasminogen activator involved in the augmented binding to fibrin after limited digestion with plasmin”, J. Biol. Chem.264(21), pp. 12604- 12610.
17.
Cartwright T. (1992), “Production of t-PA from animal cell culture”, Animal.Cell Biotechnol. 5, pp. 218- 245.
19.
Collen D., Lunen R. (2004), “Tissue- type plasminogen activator: a historical perspective and personal account”, J. Thromb. Haemost 2, pp. 541- 546.20.
Degeng S.J.F., Rajput B., Reich E. (1986), “The human tissue plasminogenactivator gene”, J. Biol. Chem. 261(15), pp. 6972- 6985.
21.
Demaerschalk B.M., Yip T.R. (2005), “Economic benefit of increasing utilization of intravenous tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke in the United States”, Stroke 36, pp. 2500- 2503.22.
Demain A.L. (2005), “The Biopharmaceutical revolution”, TeknoScienze 22(11).23.
Edlund T., Ny T., Ranby M., Hedon L., Palms G., Holmgren E., JosephsonS. (1983), “Isolation of cDNA sequences coding for a part of human tissue plasminogen activator”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, pp. 349- 352.
24.
Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. (2003), “The production ofrecombinant pharmaceutical proteins in plants”, Nat. Rev. Genet. 4, pp.
794- 805.
25.
Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Twyman R.M. (2004), “Plant- based production of biopharmaceuticals”, Curr. Opin. Plant Biol. 7, pp. 152- 158.26.
Griffiths J.B., Electricwala A. (1987), “Production of tissue plasminogen activators from animal cells”, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 34, pp. 147- 166.27.
Hoffman J.R. (2005), “Tissue plasminogen activator (tPA) for acuteischaemic stroke: Why so much has been made of so little”, Med. J. Aust. 179(7), pp. 333-334.
28.
Kalyan K.S., Lee S.G., Wilhelm J., Fu K.F., Hum W.T., Rappaport R., Hartzell R.W., Urbano C., Hung P.P. (1988), “Structure-function analysis with tissue-type plasminogen activator”, Biochem. J. 263 (8), pp. 3971-3378.29.
Laemmli U.K. (1970), “Cleavage of Structural Proteins during the Assemblyof the Head of Bacteriophage T4”, Nature 22, pp. 680- 685.
30.
Leonardi A., Brun P., Sartori M.T., Cortivo R., DeDominicis C., Saggiorato G., Abatangelo G., Secchi A.G. (2005), “Urokinase plasminogen activator,uPa receptor, and its inhibitor in Vernal keratoconjunctivitis”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, pp. 1364- 1370.
31.
Li Z.L., An J. (2002), “Cloning and identification of human tissue - type plasminogen activator gene”, Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao 22(1), pp. 22- 24.32.
Ma J.K.C., Drake P.M.W., Christou P. (2003), “The production ofrecombinant pharmaceutical protein in plant”, Nature 4, pp. 794- 805.
33.
Ma J.K.C., Barros E., Bock R., Christou P., Dale P.J., Dix P.J., Fischer R.,Irwin J., Mahoney R., Pezzotti M., Schillberg S., Sparrow P., Stoger E., Twyman R. M. (2005), “Molecular farming for new drugs and vaccines”,
EMBO rep. 6(7), pp. 593- 599.
34.
Markland W., Pollock D., Livingston D.J., (1989), “Structure - function analysis of tissue-type plasminogen activator by linker-insertion, point and deletion mutagenesis”, Protein Eng. 3(2), pp. 117- 125.35.
Martegani E., Forlani N., Mauri I., Porro D., Schleuning W.D., Alberghina L. (1992), “Expression of high levels of human tissue plasminogen activator in yeast under the control of an inducible GAL promoter”, Appl.Microbiol. Biotechnol. 37, pp. 601- 608.
36.
Meschia J.F., Miller D.A., Brott T.G. (2002), “Thrombolytic treatment of acute ischemic stroke”, Mayo Clin. Proc. 77, pp. 254- 551.37.
Novokhatny V.V., Inghams K.C., Medved L.V. (1991), “Domain structure and domain-domain interactions of recombinant tissue plasminogen activator”, J. Biol. Chem. 266(20), pp. 12994- 13002.38.
Ny T., Elgh F., Lund B. (1984), “The structure of the human tissue-type plasminogen activator gene: Correlation of intron and exon structures to functional and structural domains”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(17), pp. 5355- 5359.39.
Otter M., Kuiper J., Bos R., Rijken D.C., Berkel J.C.V. (1992), “Characterization of the interaction both in vitro and in vivo oftissue-type plasminogen activator (t-PA) with rat liver cell”, Biochem. J. 284, pp. 545- 550.40.
Pennica D., Holmes W.S., Kohr W.J., Harkins R.N., Vehar G.A., Ward C.A., Bennett W.F., Yelverton E., Seeburg P.H., Heyneker H.L., Goeddel D.V. (1983), “Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E. coli”, Nature 301, pp. 214- 221.41.
Petersen T.E., Martzen M.R., Ichinose A., Davie E.W. (1990), “Characterization of the gene for human plasminogen, a key proenzyme in the fibrinolytic system”, J. Biol. Chem. 265(11), pp. 6104- 6111.42.
Qui J., Swartz J.R., Georgiou G. (1998), “Expression of active human tissue- type plasminogen activator in Escherichia coli”, Appl. Envir. Microbiol. 64 (12), pp. 4891- 4896.43.
Reichert J.M. (2002), “Therapeutic monoclonal antibodies: trends in development and approval in the US”, Curr. Opin. Mol. Ther. 4(2), pp.110- 118.
44.
Reichert J.M., Paquette C. (2003), “Therapeutic recombinant proteins: trends in US approvals 1982- 2002”, Curr. Opin. Mol. Ther. 5(2), pp. 139- 147.45.
Rijken D.C. (1988), “Relationships between structure and function of tissue-type plasminogen activator”, Klin. Wochenschr. 66(12), pp. 33- 39.
46.
Rouf S.A., Moo- Young M., Chisti Y. (1996), “Tissue- type plasminogen activator: Characteristics, applications and production technology”,Biotechnol. Adv. 14(3), pp. 239- 266.
47.
Salonen E.M., Saksela O., Vatio T., Vaheri A., Nielsen L.S., Zeuthen J. (1985), “Plasminogen and tissue-type plasminogen activator bind to immobilized fibronectin”, J. Biol. Chem. 260(22), pp. 12302- 12307.48.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (2001), “Molecular Cloning: Alaboratory manual”. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor.
49.
Siren V., Peltonen J., Vaheri A. (2006), “Plasminogen activators and theirinhibitor gene expression in cutaneous NF1- related neurofibromas”, Arch.
50.
Twyman R.M., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Fisher R. (2003), “Molecular farming in plants: host systems and expression technology”,Trends Biotechnol. 21, pp. 570- 578.
