Sau khi plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa h-tPA được biến nạp thành công vào tế bào biểu hiện E.coli chủng BL21, protein tái tổ hợp được tiến hành biểu hiện và kiểm tra theo các bước sau:
- Chọn một khuẩn lạc (E. coli BL21) nuôi lắc ở 200 v/p trong 5ml LB lỏng có bổ sung Amp (100g/ml) ở 37oC qua đêm;
- Ngày tiếp theo, hút 2ml dịch vi khuẩn trên vào 100 ml LB lỏng có bổ sung Amp (100g/ml). Tiếp tục nuôi lắc ở 200 v/p ở 37oC đến OD600= 0,6- 0,8;
- Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG nồng độ 1mM. (Tỷ lệ 100 l IPTG cho 100ml dịch nuôi). Để tế bào tiếp tục sinh trưởng trong 3h;
Kiểm trabiểu hiện: hút 1ml dung dịch nuôi cấy sang ống eppendoft mới. Ly tâm thu tế bào và bổ sung 100 µl loading dye. Voltex phá tế bào, biến tính protein trong 5 phút ở 95oC;
- Dùng 10l mẫu để điện di SDS-PAGE cùng với thang chuẩn protein và mẫu đối chứng âm là dịch phá màng của E.coli BL21 và dịch phá màng E.coli BL21chứa vector rỗng được cảm ứng IPTG;
- Phần dịch nuôi cấy còn lại được ly tâm thu tế bào. Giữ tế bào ở -20oC chờ bước tinh chế protein.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA
3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hoá h-tPA bằng kỹ thuật PCR
Gen mã hóa h-tPA sử dụng trong nghiên cứu đã được tạo dòng trong vector pUC18. Để kiểm tra cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA trong vector pUC18 sử dụng cặp mồi M13, sau đó trình tự này được phân tích và so sánh với trình tự NM000930 trên Ngân hàng Gen Quốc Tế. Kết quả phân tích và so sánh cho thấy, trình tự cDNA trong vector pUC18 có độ tương đồng tới 99% với trình tự so sánh, các điểm đột biến giữa h-tPA với trình tự NM000930 không làm thay đổi trình tự acid amin. Trình tự bao gồm đầy đủ các thành phần cần thiết cho biểu hiện gen như mã mở đầu, mã kết thúc, đúng khung đọc...
Sau khi xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR với hai cặp mồi đặc hiệu và khuôn là vector pUC18 tái tổ hợp để tạo dòng cDNA này trong vector biểu. Hai cặp mồi đã được chúng tôi thiết kế mang các trình tự nhận biết của enzyme hạn chế để sử dụng cho các quá trình ghép nối gen và kiểm tra sản phẩm. Việc thiết kế thêm trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế vào mồi tuân theo một số nguyên tắc như trình tự nhận biết chỉ có một vị trí trong vùng gắn đa vị của vector và không có mặt trong gen cần tạo dòng; số nucleotide phía ngoài trình tự nhận biết từ 3- 6 nucleotide nhằm bảo vệ các trình tự này và giúp các enzyme cắt tốt hơn. Trong nghiên cứu này, đối với vector pGEX6p1 chúng tôi sử dụng hai enzyme là BamHI và XhoI, vì chúng có mặt trong vùng cắt gắn đa vị của vector biểu hiện pGEX6p1; đối với vector pET21a(+), chúng tôi đã sử dụng hai enzyme NdeI và XhoI. Các enzyme này đều không có điểm cắt trên cDNA mã hoá h-tPA. Trình tự hai cặp mồi như sau:
Cặp 1:
htPA-NdeI F2: 5’-GTG AAG CAC ATA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G-3’ htPA-XhoI R3: 5’-GTG GTG CTC GAG CGG TCG CAT GTT GTC-3’
Cặp 2:
htPA-BamHI F2: 5’-ATT CCG TGG ATC CAC CAT GGA TGC AAT GAG G-3’ htPA-XhoI R4: 5’-GTG GTG CTC GAG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’
Kỹ thuật PCR là phương pháp được sử dụng nhằm nhân một đoạn DNA nằm giữa hai vùng đã biết trình tự. Hai đoạn oligonucleotide được sử dụng như mồi cho một loạt phản ứng tổng hợp được xúc tác bởi enzyme DNA polymerase. Các đoạn oligonucleotide có trình tự khác nhau và bổ sung cho trình tự nằm ở hai đầu của trình tự DNA mẫu được nhân lên. DNA mẫu bị biến tính bởi nhiệt độ trong sự có mặt của hai đoạn oligonucleotide và bốn loại dNTPs. Hỗn hợp phản ứng sau đó được hạ xuống tới nhiệt độ cho phép mồi oligonucleotide bám vào trình tự đích, tiếp theo mồi được kéo dài bởi DNA polymerase. Số chu kỳ được nhắc lại nhiều lần từ 25 đến 35 chu kỳ. Bởi vì sản phẩm của một vòng của quá trình nhân là mẫu cho quá trình tiếp theo, mỗi chu kỳ cho hai sản phẩm DNA nên số lượng sản phẩm là phản ứng mũ một đoạn đôi DNA được xác định bởi đầu cuối 5’ của đoạn mồi oligonucleotide và chiều dài được xác định bởi khoảng cách giữa hai mồi. Hai cặp mồi này có thể được thiết kế theo yêu cầu của nghiên cứu. Việc nhân gen bằng PCR từ vector dễ hơn so với nhân gen từ hệ gen nên thường thu được lượng sản phẩm lớn, đặc hiệu do số điểm bám của mồi trên vector tái tổ hợp ít, tỷ lệ bám mồi cao...
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành phản ứng nhân cDNA mã hóa h-tPA. Thành phần và chu trình nhiệt được trình bày ở phần 2.2.3. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA
M: Marker 1kb
1: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 1 2: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 2
Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử khoảng 1,7kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết. Băng chính đều sáng, đậm, rõ nét và sẽ được tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành ghép nối gen.
3.1.2. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) 3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hoá h-tPA bằng enzyme
hạn chế
Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi đã tiến hành chiết và làm sạch sản phẩm qua cột theo kit Wizard® SV Gel and Clean- Up System. Hệ thống này dựa trên khả năng kết hợp của DNA với màng silica trong sự có mặt của hỗn hợp muối, hệ thống màng có thể kết hợp với 40µg DNA và cho phép thu hồi sản phẩm PCR trong 15 phút. Quá trình tinh sạch này giúp loại bỏ khỏi sản phẩm PCR các thành phần không mong muốn như các đoạn DNA vệ tinh, các NTPs... Sau khi tinh sạch, hai mẫu sản phẩm PCR được xử lý bằng hai cặp enzyme hạn chế tương ứng là
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
NdeI/XhoI và BamHI/XhoI. Thành phần và quá trình xử lý được trình bày ở mục
2.2.4. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế
Sau khi nghiên cứu tài liệu và điều kiện vật chất phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành biểu hiện protein h-tPA trên vi khuẩn E. coli chủng BL21 với hai vector biểu hiện là pET21a(+) và pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA. Vector pET21a(+) là vector mạnh để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Gen đích được tạo dòng trong plasmid pET21a(+) được điều khiển bởi tín hiệu dịch mã tốt của phage T7, biểu hiện dưới sự tổng hợp của T7 RNA polymerase trong tế bào chủ. Vector pET21a(+) là vector mang trình tự T7 ở đầu N và trình tự đuôi His ở đầu C. Vector này mang chỉ thị chọn lọc là gen kháng kháng sinh (kháng Amp và Kanamycin). Vùng tạo dòng/ biểu hiện được điều khiển bởi T7 polymerase. Trình tự này được xác định, giải trình tự khi sử dụng mồi đầu T7. Hệ thống biểu hiện này được cảm ứng bởi IPTG hoặc lactose trong quá trình nuôi cấy.
Vector pGEX6p1 điều khiển tổng hợp protein ngoại lại bởi promoter tac, promoter này được cảm ứng bởi isopropyl b-D thiogalactoside (IPTG). Vector pGEX6p1 được thiết kết gồm có một gen lacIq, sản phẩm gen lacIq là protein ức chế kết hợp với vùng operator trên promoter tac, làm ngăn cản quá trình biểu hiện cho tới khi cảm ứng bởi IPTG, qua đó điều khiển quá trình biểu hiện của gen được thêm vào. Đầu 3’ vùng đa nối có chứa đoạn gen mã hoá Glutathione S- Transferase - GST, đây là một protein giúp quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp dễ hơn. Ngoài ra, vector pGEX6p1 có một số ưu điểm như: mức độ biểu hiện cao, điều kiện tinh sạch protein đơn giản, ảnh hưởng của kháng nguyên và chức năng của protein là nhỏ nhất.
Quá trình cắt mở vòng hai vector cũng sử dụng hai cặp enzyme là NdeI/XhoI và
BamHI/XhoI tương tự như đối với sản phẩm PCR. Thành phần và quá trình xử lý đối với
vector pET21a(+) và pGEX6p1 được trình bày ở phần 2.2.4. Sau khi cắt với enzyme, vector được xử lý với phosphatase để loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’, làm giảm quá trình tự nối của vector. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.2. Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế
Kết quả điện di trên hình 3.2 cho thấy sản phẩm cắt tương đối sạch và đủ điều kiện tiến hành phản ứng ghép nối.
3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+)
Chúng tôi đã tiến hành ghép nối cDNA mã hóa h-tPA với các vector pET21a(+) và pGEX6p1 tạo các vector tái tổ hợp mang gen mã hoá h-tPA. Do cả sản phẩm PCR và vector đều đã được xử lý bằng hai enzyme tương ứng nên dưới tác dụng của enzyme T4 ligase, sản phẩm PCR và vector có thể nối lại với nhau tạo vector tái tổ hợp. Thành phần và phản ứng ghép nối giữa vector và sản phẩm PCR đã trình bày ở phần 2.2.5. Phản ứng ghép nối được tiến hành ở 16oC, qua đêm.
3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA 3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phƣơng pháp
sốc nhiệt
Sản phẩm lai giữa vector và sản phẩm PCR được biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt trong 70 giây ở 42oC. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ ml) ở 37°C qua
M: Marker 1kb
1: Vector pGEX6p1/BamHI+XhoI 2: Vector pET21a(+)/NdeI+XhoI 3: cDNA h-tPA/NdeI+XhoI 4: cDNA h-tPA/BamHI+XhoI
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
đêm. Kết quả, chúng tôi đã thu được rất nhiều khuẩn lạc, là các dòng tế bào vi khuẩn khác nhau. Do trong môi trường có chất kháng sinh nên chỉ có những khuẩn lạc nào mang vector mới mọc được, các dòng tế bào vi khuẩn này gồm 2 loại tế bào khác nhau: tế bào mang vector nhưng không mang đoạn chèn và tế bào mang vector và đoạn chèn. Vì vậy để xác định dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc thông qua tách chiết plasmid, xử lý bằng enzyme hạn chế, PCR và xác định trình tự.
3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA
Tách chiết DNA plasmid
Plasmid được tách chiết nhằm xác định vector nào mang đoạn chèn và vector nào không mang đoạn chèn. Phương pháp tách plasmid được trình bày ở mục 2.2.7.
Để tách chiết DNA plasmid, một số khuẩn lạc được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp ở 37oC từ 12- 14h. Phương pháp tách chiết plasmid gồm 3 bước chính: thu nhận và phân giải tế bào, làm sạch plasmid và kết tủa DNA. Dung dịch I (sol I) có tác dụng rửa sạch tế bào, dung dịch II (sol II) có chứa SDS và NaOH có tác dụng phá màng tế bào và ức chế hoạt động của nuclease, không cho chúng phân giải DNA do Mg2+ (một nhân tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease) bị liên kết với EDTA, khi cho tiếp dung dịch III (sol III) có chứa axetate và axetic acid thì pH môi trường chuyển thành acid yếu gần với điểm đẳng điện của DNA, vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và dễ dàng tách được nhờ ly tâm. Do trong tế bào vi khuẩn có chứa hai dạng DNA là DNA nhiễm sắc thể và DNA plasmid nên việc tách và tinh sạch DNA plasmid là rất quan trọng, DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dụng dịch I, II, III. Do DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn và liên kết chặt chẽ với protein nên khoảng thời gian ngắn giữa các lần thêm dung dịch không kịp thoát ra ngoài.
DNA plasmid thu được sau khi tách chiết từ tế bào vi khuẩn thường tồn tại ở 3 dạng: dạng siêu xoắn được tạo ra do liên kết hydro giữa một số phần của phân tử DNA plasmid hay do lực hút tĩnh điện giữa các phần của phân tử với nhau, dạng vòng mở do bị đứt gãy một mạch đơn của chuỗi DNA mạch kép và dạng mạch
thẳng khi cả hai mạch DNA dều bị đứt gãy. Dạng siêu xoắn có cấu trúc không gian gọn nên khi điện di chúng thường chạy nhanh nhất, tiếp đến là mạch thẳng và cuối cùng là mạch vòng. DNA sau đó được hoà tan trong dung dịch RNase 0,01mg/ml nhằm loại bỏ RNA và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Theo lý thuyết khi một DNA plasmid mang gen ngoại lai, chúng sẽ có kích thước bằng tổng kích thước của plasmid và kích thước của gen ngoại lai. Do vậy trong điện di đồ, chúng sẽ chạy chậm hơn (thấp hơn) so với đối chứng âm (các plasmid chưa mở vòng), dựa vào đó chúng ta có thể kết luận sơ bộ được những plasmid này có kích thước lớn hơn và có thể chúng mang gen ngoại lai.
Hình 3.3. Chọn dòng pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA)
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
ĐC: Đối chứng âm
1- 7: DNA plasmid của các dòng pGEX6p1
Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các đường chạy đều xuất hiện 2 băng chạy trước rõ nét hơn, điều đó chứng tỏ lượng DNA plasmid của chúng tôi thu được tồn tại ở dạng siêu xoắn nhiều hơn dạng thẳng. Hình 3.3 cho thấy, đối với các dòng mang vector pGEX6p1, dòng 1 và 3 (ký hiệu pGEX/htPA p1 và pGEX/htPA p3) là hai dòng có kích thước lớn hơn các dòng khác và lớn hơn so với đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA.
Đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có thể mang cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).
Hình 3.4. Chọn dòng pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA)
ĐC: Đối chứng âm (vector pET21a(+) không mang h-tPA) 1- 5: DNA plasmid của các dòng pET21a(+)
Tương tự, đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có kích thước lớn hơn các dòng khác và đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Để chứng minh chính xác xem đoạn xen vào plasmid có phải là đoạn gen mã hoá h- tPA hay không, chúng tôi đã tiếp tục kiểm tra bằng enzyme hạn chế, tiến hành PCR và giải trình tự.
Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng xử lý enzyme hạn chế
Hai cặp enzyme NdeI/XhoI và BamHI/XhoI đã được sử dụng để tạo đầu bổ
sung cho vector và đoạn chèn nên để kiểm tra, chúng tôi cũng sử dụng hai cặp enzyme này nhằm kiểm tra các dòng được chọn có mang đoạn chèn hay không. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm xử lý enzyme của plasmid tái tổ hợp bao gồm hai đoạn gen, một đoạn có kích thước tương ứng với vector gốc (vector mở vòng) và một đoạn có kích thước tương ứng với đoạn chèn (cDNA mã hóa h-tPA). Thành phần và quy trình phản ứng được tiến hành như trình bày ở mục 2.2.4. Các sản phẩm xử lý enzyme được điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.5. Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, sau khi xử lý các vector tái tổ hợp bằng hai cặp enzyme tương ứng, chúng tôi thu được hai băng có kích thước khác nhau; đối
M: Marker 1kb 1: pGEX/htPA p1 2: pGEX/htPA p3
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
với vector pGEX6p1, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 5kb