Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid

Nguyên tắc: Tách chiết plasmid dựa trên hai nguyên ngắc cơ bản là DNA nhiễm sắc thể của E. coli có kích thước lớn hơn rất nhiều so với DNA plasmid; do trọng lượng, kích thước khác nhau giữa các dạng DNA E. coli mà hầu hết DNA

plasmid tách ra dưới dạng vòng đóng [48].

Hóa chất tách chiết DNA plasmid gồm: Sol I, Sol II, Sol III, dung dịch loại protein (hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol = 24:1), dung dịch TE 0,01M, pH 8,0.

Quy trình tách chiết DNA plasmid của E. coli

- Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào E. coli trong 1,7ml môi trường LB (có kháng

sinh Amp nồng độ 50g/ml) ở 370C, 200 v/p; Ngày hôm sau, ly tâm dịch nuôi cấy trên ở 6.000 v/p, 7 phút; loại bỏ dịch;

- Hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 150l dung dịch I để lạnh, voltex làm tan cặn tế bào, sau đó giữ trong đá 5 phút;

- Bổ sung 150l dung dịch II, đảo đầu ống Eppendorf nhẹ nhàng và giữ trên đá 10 phút;

- Thêm 150l dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3 – 5 phút; - Thêm 500 l dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ thể tích 24:1). Đảo đều hỗn hợp;

- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Chiết và chuyển pha lỏng ở phía trên sang một ống eppendorf mới; Thêm 50 l CH₃COONa 3 M (pH 5,2) và 1 ml cồn 100 %. Đảo đều và giữ lạnh ở -200C trong 3 giờ;

- Rửa cặn bằng 0,2ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút, làm khô và hoà cặn trong 40l TE 0,01M, giữ ở -20oC; Sau đó đổ bỏ cồn. Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút;

- Hòa tan tủa DNA trong 50 l nước chứa RNase (0,01 mg/ml). Bảo quản DNA ở -20^oC; Kiểm tra DNA bằng gel agarose 0,8 %.

Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm tra bằng enzyme hạn chế và PCR kiểm tra. Thành phần cắt kiểm tra được nêu ở Bảng 9 phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 2h. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR kiểm tra giống với quá trình nhân gen. Sản phẩm cắt và PCR kiểm tra được điện di trên gel agarose 0,8%.