2.3.1. Chuẩn bị tế bào khả biến
Tế bào khả biến đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp của McCormac 1998, có cải tiến: Chủng khuẩn đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc nuôi ở nhiệt độ thích hợp (vi khuẩn A.tumefaciens - 280C), qua đêm. Sau đó, lấy một khuẩn lạc đơn vào 3ml môi trƣờng LB lỏng, lắc 200vòng/phút, nuôi qua đêm. Chuyển 0,5ml dịch sang 50ml môi trƣờng LB lỏng, lắc 200vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp, khi nồng độ vi khuẩn đạt OD = 0,6 – 0,8 tiến hành chuyển sang ống ly tâm lạnh. Ly tâm, 6000vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Thu cặn, hoà tan nhẹ nhàng trong 5ml CaCl2 0,1M. Chia vào mỗi ống eppendorf 100μl dịch tế bào, bổ sung 50μl glycerol 50%, làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -800C tới khi làm biến nạp.
2.3.2. Biến nạp plasmid vào tế bào vi khẩn
Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens bằng phƣơng
pháp xung điện
Chuẩn bị các tế bào A.tumefaciens khả biến trong các cuvet đã khử trùng. Đặt các ống cuvet vào trong đá, bổ sung 2μl plasmid tái tổ hợp vào 100μl đựng sẵn tế bào khả biến A.tumefaciens. Đảo nhẹ, ủ trong đá 5phút. Tiến hành xung điện: 2,5kw, 25μF, 400Ω trong 4-5 giây. Chuyển ngay ống vào dịch đá, bổ sung 1ml môi trƣờng SOC, trộn nhẹ nhàng và chuyển sang ống eppendorf 2ml nuôi lắc trong vòng 1h. Cấy trải 100μl dịch tế bào vào đĩa môi trƣờng LB có bổ sung kanamycin 50mg/l, nuôi từ 24- 48h cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc.
2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
DNA plasmid đƣợc tách theo phƣơng pháp của Sambrook và cs, có cải tiến: - Nuôi cấy vi khuẩn chứa plasmid cần tách chiết trong 2 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log (sau thời gian khoảng 14-16h) ở nhiệt độ thích hợp .
- Thu cặn tế bào vi khuẩn từ dịch nuôi bằng ly tâm 7000vòng/phút trong 10 phút, 4oC. - Hòa tan cặn trong 100µl Sol I (Tris HCl 50mM, pH 8,0; EDTA 10mM), nhiệt độ phòng, 10 phút, vortex mạnh để phá vỡ màng tế bào.
- Thêm 100µl Sol II (NaOH 0,2M; SDS 1%) nhiệt độ phòng, 10 phút, đảo đầu nhẹ. SDS có tác dụng phá vỡ màng tế bào.
- Bổ sung 100 µl Sol III (CH3COOK) tiếp ngay sau đó, rồi để trong lạnh khoảng 5 phút. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào đƣợc loại.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu dịch.
- Thêm 25:24:1 theo tỷ lệ 1:1, đảo đều hỗn hợp. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, thu lớp dịch lỏng ở phía trên sang một ống eppendorf sạch.
- Thêm isopropanol theo tỷ lệ 1:1. Tủa ở -20oC. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o
C. Thu cặn.
- Rửa cặn bằng Ethanol 70%. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Thu cặn. Lặp lại bƣớc này 2 lần. Làm khô cồn bằng máy hút chân không SpeedVac trong 5 phút. Hòa tan tủa DNA trong 50µl nƣớc chứa ARNse (0.01mg/ml). Bảo quản DNA ở -20o
C.
2.3.4. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
DNA đƣợc tách chiết và tinh sạch bằng phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984), có cải tiến.
Hóa chất:
-Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam
- -Mercapto ethanol : 250 l
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml
- NaCl 5M : 30 ml - Tris HCl 8,0 : 15 ml - H2O : 55 ml - Đệm TE EDTA pH 8,0 gồm: - Tris HCl 8,0 : 10 mM - EDTA 8,0 : 1 mM - Enzyme Rnase: 10 g/ml - Cồn tuyệt đối lạnh - NaCl 5 M
- Dung dịch (24:1) gồm Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 24/1.
- Dung dịch (25:24:1) gồm Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 25/24/1. - Dung dịch rửa là cồn 75%.
Quy trình:
- Nghiền 0,3 - 0,5 gam lá đậu tƣơng trong nitơ lỏng thành bột mịn.
- Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút.
- Ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhƣng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại 2 lần).
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ rồi 20 trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5 l NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm.
- Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
- Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (thực hiện 2 lần). - Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (5 phút).
- Bố sung 30 l H2O + 1 l RNAse sau đó ủ ở 370C trong 30 phút. Đem cất giữ ở -200
C.
2.3.5. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleoic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dƣới tác động của dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lƣợng và kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển trong điện trƣờng từ cực âm sang cực dƣơng.
Hóa chất: Agarose 1,0% (hòa 1,0g agarose trong 100ml dung dịch đệm TAE 1X). Đệm TAE 1X, EtBr 10mg/ml, đệm tra mẫu (glycerol 20%; tris- HCL 0.1M, pH 8.0; EATA 0.01 M, pH 8.0; Bromophenol blue 0.25%).
Quy trình: Agarose 1,0% đƣợc đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50- 60o
C. Bổ sung EtBr vào bản gel với nồng độ 10µg/ml , đổ dung dịch vào khay gel đó cài sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau 30-60 phút, khi gel đó đông cứng, tháo răng lƣợc, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel ~2mm.Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 80v, cƣờng độ dòng điện vào khoảng 60-80mA. Theo dõi sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thƣờng sau khoảng 30 phút).Gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại, DNA đƣợc hiện lên dƣới dạng các vạch sáng, ảnh điện đƣợc di đƣợc chụp trên máy Bio-Rad với tia UV có bƣớc sóng 320nm.
2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh
- Khử trùng hạt:Hạt đƣợc khử trùng theo quy trình khử trùng hạt của Xue R.G. et al. (2006) đã cải tiến và đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng: Ngâm hạt với nƣớc cất vô trùng trong 30 phút. Sau khi loại bỏ nƣớc, lắc hạt với ethanol 70% trong 3 phút, rửa hạt bằng nƣớc cất vô trùng 1 lần. Thêm hạt với NaClO 15%, trong thời gian 12 phút. Rửa hạt bằng nƣớc cất vô trùng 3-4 lần (rửa đến khi hết bọt). Các dung dịch khử
trùng có khả năng xâm nhập và len lỏi vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt hạt đậu để có thể khử sạch hạt khỏi nấm và vi khuẩn (bởi vì hạt đậu tƣơng đƣợc thu hoạch từ đồng ruộng nên chứa nhiều các loại vi khuẩn và nấm).
- Nuôi cấy nảy mầm hạt: Hạt sau khi đã đƣợc khử trùng, đƣa ra đĩa petri, dùng dao số 11 và panh tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt. Đƣa hạt ra đĩa petri, dùng dao số 11 tách bỏ vỏ ngoài và nuôi cấy nảy mầm hạt trên môi trƣờng nảy chồi BGM.
- Nuôi cấy nảy chồi: Mẫu dùng để nuôi cấy nảy chồi và thao tác gây tổn thƣơng trên mẫu đồng thời đƣợc sử dụng trong biến nạp, áp dụng phƣơng pháp của Olhoft P.M. và cộng sự (2003), Paz.et al (2006), Xue R.G. et al (2006) với một số cải tiến. Nốt lá mầm sau nảy mầm 3-5 ngày đƣợc dùng làm vật liệu. Quy trình: Hạt đậu tƣơng sau nảy mầm 3-5 ngày đƣợc loại bỏ một phần trụ dƣới lá mầm, phần còn lại dài 2-3 mm. Dùng dao tách đôi hai lá mầm, sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh. Các mẫu nuôi cấy này đƣợc cắt bỏ chồi đỉnh và gây tổn thƣơng xung quanh mặt trong nốt lá mầm 12-14 vết thƣơng/mẫu, sâu 0,5 mm bằng mũi dao. Sau khi gây tổn thƣơng, mẫu nuôi cấy đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung BAP 1,5mg/l (phụ lục II) để kích thích khả năng tái sinh tạo đa chồi. Điều kiện chiếu sáng 18h/ngày, ở 250
C.
- Kéo dài chồi: Tách riêng biệt các chồi từ cụm chồi thu đƣợc chuyển sang môi
trƣờng kéo dài (SEM) có bổ sung GA3 (phụ lục II ). Nuôi 4 tuần ở chế độ 250C, với 18/6h sáng/tối trong tủ nuôi cây.
- Ra rễ: Khi chồi phát triển có chiều dài khoảng trên 4 cm đƣợc chuyển sang môi trƣờng tạo rễ RM (phụ lục II) nuôi sáng ở 250
C, thời gian từ 2-3 tuần.
- Chuyển cây ra bầu đất: Cây tái sinh trên môi trƣờng RM có 3-4 rễ, cao 5-7 cm đƣợc chuyển ra trồng trên bầu đất, tƣới nƣớc thƣờng xuyên với lƣợng vừa đủ, tránh úng.
Hạt đậu tƣơng
Khử trùng
Nuôi cấy nảy mầm
Gây tổn thƣơng Nuôi cấy nảy chồi
Tách cụm chồi Kéo dài chồi
Ra rễ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ra cây
2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng
(1) Chuẩn bị Agrobaterium
Chủng vi khuẩn Agrobaterium chọn lọc đã có plasmid vector pX2- C1mpi:Cry1B:nos mang gen kháng côn trùng cryIB và chỉ thị chọn lọc hpt, gen chỉ thị sàng lọc gfp. Trƣớc khi biến nạp, chủng vi khuẩn A. tumefaciens từ nguồn lƣu giữ đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l để chọn đƣợc những khuẩn lạc mang vector pX2-C1mpi:Cry1B:nos. Lấy 2 khuẩn lạc đơn từ đĩa nuôi trong 50 ml LB lỏng có bổ sung kanamycin 50mg/l, nuôi lắc qua đêm ở 250
C, 120 vòng/phút để việc chọn lọc khuẩn mang vector PX2-C1mpi : Cry1B :nos tốt hơn. Mật độ vi khuẩn đƣợc xác định bằng máy quang phổ khả kiến ở bƣớc sóng 600nm (OD600). Một giờ trƣớc khi biến nạp, ly tâm dịch khuẩn ở 4.000 vòng/phút, 40
C trong 10 phút để thu cặn tế bào. Cặn tế bào đƣợc làm loãng trong dung dịch CCM lỏng (Phụ lục), nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C khoảng 40-60 phút trƣớc khi biến nạp.
(2)Chuẩn bị mẫu đậu tương cho biến nạp: Mẫu đậu tƣơng đƣợc chuẩn bị giống mục 2.3.6
(3) Biến nạp: Biến nạp bao gồm bƣớc gây tổn thƣơng và xâm nhiễm, đồng nuôi cấy.
Gây tổn thƣơng mẫu đƣợc tiến hành tƣơng tự mục 2.3.6 với các phƣơng thức lây nhiễm ở thí nghiệm 4 , mỗi nửa nốt lá mầm sau khi gây tổn thƣơng chuyển qua bình tam giác chứa môi trƣờng lây nhiễm lắc nhẹ 70-80 vòng/phút trong khoảng thời gian lây nhiễm khác nhau ở thí nghiệm 5 để tiếp tục quá trình lây nhiễm. Nuôi cấy mẫu trên môi trƣờng đồng nuôi cấy CCM (Phụ lục II), thời gian đồng nuôi cấy đƣợc bố trí nhƣ thí nghiệm 6, trong tối ở 250
C.
(4) Chọn lọc và tái sinh
Sau đồng nuôi cấy, mẫu lây nhiễm đƣợc rửa trong dung dịch SIM I lỏng có bổ sung cefotaxim 200mg/l (Phụ lục II) với thời gian rửa 1 giờ. Mẫu lây nhiễm đƣợc nuôi cấy tái sinh trên môi trƣờng SIM I đặc để tái sinh chồi 2 tuần trong điều kiện chiếu sáng 18h/ngày, nhiệt độ 250C. Sau khi có chồi xuất hiện, tiến hành cắt bỏ toàn bộ phần lá mầm, chuyển chồi hình thành sang môi trƣờng SIM II chứa hygromycin ở các nồng độ khác nhau ở thí nghiệm 8 để chọn lọc chồi chuyển gen. Thời gian chọn lọc khoảng 2 tuần ở 250C, chiếu sáng 18h/ngày. Chồi sống sót sau 2 tuần chọn lọc chuyển sang môi trƣờng SEM để kéo dài chồi.
(5) Giai đoạn kéo dài chồi, tạo rễ và đưa cây ra trồng tiến hành tương tự mục 2.3.6
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình biến nạp và tái sinh cây đậu tƣơng từ nốt lá mầm
2.3.8. Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen
2.3.8.1. Sàng lọc thông qua gen chỉ thị gfp
Mẫu nuôi cấy trên môi trƣờng SIM không bổ sung kháng sinh hygromycin, sau khi xuất cụm hiện chồi, tiến hành cắt bỏ lá mầm cụm chồi đƣợc chuyển sang đĩa vô trùng khác và kiểm tra sự biểu hiện của gen gfp bằng kính hiển vi huỳnh quang. Lựa chọn chồi có phát huỳnh quang (màu xanh sáng) để tiếp tục theo dõi, đánh giá ở các thí nghiệm sau.
2.3.8.2. Phân tích PCR
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với các cặp mồi cry1B, hpt, gfp (2.1.1) Hạt đậu tƣơng
Khử trùng bề mặt
Nảy mầm trên BGM Nuôi trong LB lỏng tạo huyền phù
Tách cụm chồi, chuyển sang môi trƣờng kéo dài chồi SEM
Ra cây
Chủng vi khuẩn A. tumefaciens
Nuôi trên môi trƣờng LB đặc, có kháng sinh
Gây tổn thƣơng nốt lá mầm và lây nhiễm Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối
Loại bỏ lá mầm, cảm ứng tạo chồi trên SIM II (Có kháng sinh chọn lọc)
Ra rễ trên RM 3-5 ngày
5 ngày
2 tuần Cảm ứng tạo chồi trên SIM I (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.9. Phƣơng pháp bố trí, theo dõi và đánh giá thí nghiệm.
2.3.9.1. Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh
TN1: Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương nghiên cứu, lựa chọn giống làm vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen
- Tiến hành: 3 giống đậu tƣơng của Việt Nam (ĐT22, DT2008 và DT84) đƣợc tiến hành nuôi cấy tái sinh theo quy trình hình 2.1. Mỗi giống sử dụng 100 hạt, ở môi trƣờng nuôi cấy nảy mầm BGM: 12 – 14 hạt/đĩa petri, ở môi trƣờng nảy chồi SIM I: 5 mẫu/đĩa petri. Chồi đƣợc kéo dài trên môi trƣờng SEM và tạo rễ trên môi trƣờng RM. Thí nghiệm tiến hành nhắc lại 3 lần.
- Đánh giá: Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh dựa trên các chỉ tiêu: Phần trăm sống sót, tỉ lệ tạo đa chồi, chiều dài chồi và rễ. Giống thích hợp sẽ đƣợc sử dụng làm vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.9.2. Đánh giá sự tương thích giữa chủng khuẩn và giống đậu tương
TN2: Xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với giống đậu tương chọn lọc
Sử dụng 3 chủng vi khuẩn EHA105, LBA4404, GV3102 chứa vector nhị thể pX2-C1mpi:cry1B:nos để biến nạp vào 1 trong 3 giống đậu tƣơng đƣợc lựa chọn ở TN1. Hiệu quả biến nạp gen đƣợc đánh giá thông qua biểu hiện tạm thời của gen gfp. Chủng vi khuẩn đƣợc chọn lọc ở sẽ sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
2.3.9.3. Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen
TN3: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp
Vector nhị thể pX2-C1mpi:cry1B:nos đƣợc biến nạp vào chủng vi khuẩn thích hợp và đƣợc sử dụng cho thí nghiệm. Nuôi lắc chủng vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh thích hợp và xác định nồng độ (OD650) bằng máy đo quang phổ kế. Thí nghiệm tiến hành ở các nồng độ OD: 0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1; 1,2. Nồng độ OD thích hợp đƣợc xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp.
TN4: Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm
Mẫu đƣợc gây tổn thƣơng và lây nhiễm trên 4 phƣơng thức: gây tổn thƣơng trong môi trƣờng nƣớc, dịch khuẩn (LB lỏng), môi trƣờng lây nhiễm lỏng (IM), gây tổn thƣơng trên đĩa sạch khô. Phƣơng thức thích hợp đƣợc đánh giá bằng phần trăm sống sót và hiệu quả biểu hiện gfp.
TN5: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm
Tiến hành lây nhiễm mẫu với vi khuẩn trong các khoảng thời gian khác nhau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ
TN6: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp
Tiến hành thử nghiệm đồng nuôi cấy mẫu trên môi trƣờng cộng sinh của vi khuẩn ở các thời gian: 0 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp đƣợc xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
TN7: Ảnh hưởng của nồng độ chất dẫn dụ Acetosyringon (AS) đến hiệu quả biến nạp gen.
Đánh giá ảnh hƣởng của chất AS ở các nồng độ 0,00 mg/l; 20mg/l; 40mg/l;