Biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
Đây là phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium nhƣ một vector sinh học để biến nạp một phần DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả là tạo đƣợc cây biến đổi gen [68]. Agrobacterium xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vết thƣơng. Khi bị tổn thƣơng, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chất phenol, hợp chất này sẽ dẫn dụ vi khuẩn
Agrobecterium biểu hiện gen vùng vir [67]. Kết quả biểu hiện của gen Vir, sợi đơn T- DNA sẽ đƣợc chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật. Vấn đề chính của phƣơng pháp chuyển gen này là sự kết hợp giữ tế bào chủ với vector tƣơng ứng.
Mặc dù ban đầu đậu tƣơng không phải là đối tƣợng đƣợc xem xét để lây nhiễm với vi khuẩn [38] cho tới khi Pederson và cộng sự (1983) đã chứng minh đậu tƣơng là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn bị kiểm soát bởi yếu tố giống [39], [42], [66]. Mặt khác, khả năng thu đƣợc các chồi chuyển gen từ những khối mô có khả năng tái sinh nhƣ phôi vô tính và nốt lá mầm ban đầu rất thấp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm tối ƣu quy trình nhƣ: bổ sung hợp chất có vai trò xúc tác nhƣ acetosyringone để kích thích sự biểu hiện của gen Vir, L-cystein, thiol hoặc sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [60], xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm [24], cải tiến nốt lá mầm làm vật liệu biến nạp, kết hợp lây nhiễm với tái sinh. Vấn đề khác khi sử dụng vi khuẩn Agrobacterium còn phụ thuộc vào chủng khuẩn , số lƣợng bản DNA copy đƣợc tổng hợp trong hệ gen thực vật, pH môi trƣờng, mức độ gây tổn thƣơng của mẫu. Trái ngƣợc với các phƣơng pháp chuyển DNA trƣợc tiếp có thể cho kết quả với số bản copy nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn đƣợc kết hợp trong một khuân mẫu không đƣợc kiểm soát.
Những cây đậu tƣơng chuyển gen đầu tiên đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp nốt lá mầm sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm trung gian đƣợc báo cáo vào năm 1988 [66]. Nốt lá mầm của giống Peking đƣợc lây nhiễm với chủng vi khuẩn Agrobacterium
mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate. Mẫu đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có chứa BAP để cảm ứng tạo chồi, kanamycin cùng với các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lƣợng vi khuẩn còn lại sau khi đồng nuôi cấy. Sau một vài tháng, cây con đƣợc tái sinh và đƣợc kiểm tra thông qua sự biểu hiện của gen gus hoặc khả năng kháng glyphosate. Chỉ 6% tổng số chồi lựa chọn đƣợc chuyển gen. Tám cây
đƣợc tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợi DNA chèn vào. Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhƣng báo cáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tƣơng khi đƣợc lây nhiễm với vi khuẩn
Agrobacterium thích hợp.
Townsend và Thomas (1993) sử dụng quy trình tƣơng tự đã thu đƣợc cây chuyển gen từ giống Pioneer 9341. Các yếu tố quan trọng giúp họ thành công đó là (1) sử dụng chất acetosyringone, (2) giới hạn nhiệt độ giai đoạn đồng nuôi cấy đƣợc kiểm soát trong khoảng 18-280C, (3) mật độ tế bào vi khuẩn lây nhiễm từ 108
đến 3 x 109/ml, (4) sử dụng axit pyroglutamic để bổ sung vào trong môi trƣờng tái sinh.
Gần đây vi khuẩn Agrobacterium và nốt lá mầm cũng đƣợc sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pod Mottle (một loại vius rây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tƣơng [41]. Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau đƣợc tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu. Phân tích Southern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây R1. Khoảng 30% cây R2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu đƣợc xét nghiệm ELISA (Enzym-linked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng kháng hoàn toàn với virus này. Tính trạng hình thái không bị biến đổi so với thế hệ R1.
Parrott và cộng sự (1989) đã đƣa ra một phƣơng pháp chuyển gen khác đó là sử dụng vi khuẩn Agrobacterium lây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo phôi vô tính sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ba cây chuyển gen có chứa gen zein kích thƣớc 15kD đƣợc hình thành. Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và khi phân tích các cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa gen zein 15kD.
Gần đây, một phƣơng pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã đƣợc phát triển để biến nạp vi khuẩn Agrobacterium mang gen vào thẳng tế bào mô đích. Kỹ thuật mới này gọi là SAAT (Sonicate Assisted Agrobacterium – media transformation). Sử dụng SAAT với nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi vô tính đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và không có hiện tƣợng thể khảm. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là thời gian nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với A.grobacterium đƣợc rút ngắn. Với kỹ thuật hiển vi điện tử quét, nhóm tác giả khám phá ra SAAT, tạo ra những rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép Agrobacterium dễ dàng đi vào mô đích mong muốn không giống nhƣ phƣơng pháp chuyển nạp gen khác. Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trƣởng đã làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan nhƣ: lá, nốt lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện GUS tăng gấp 100-400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây vân sam trắng (white spruce), lúa mì, ngô và đậu tƣơng, đồng thời gen chuyển nạp tƣơng đối ổn định qua các thế hệ. Cũng với phƣơng pháp trên, C. A. Meurer và các cộng sự (1998) [24] áp dụng trên 28 giống đậu tƣơng. Nhóm tác giả cho
rằng, để thực hiện thành công phƣơng pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu tố nhƣ: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mô mong muốn. Với phƣơng phƣơng pháp SAAT, chọn những cụm phôi có 10-20 phôi (đƣờng kính 2-4 mm) đƣợc lây nhiễm với 1 ml dịch khuẩn A.tumefaciens có nồng độ OD600 =0,1-0,5 trong thời gian 0-300 giây. Sau 2 ngày trên môi trƣờng lây nhiễm có 0,1mM Acetosyringone mẫu đƣợc chuyển lên môi trƣờng chứa 400 mg/l timentin. Hai tuần sau khi SAAT, chuyển mô sang môi trƣờng có 20 mg/l hygromycin và 400 mg/l Timentin. Những dòng chuyển gen đƣợc quan sát và phân lập khoảng 6-8 tuần sau khi SAAT.
Kỹ thuật này cho hiệu quả chuyển gen cao hơn so với các phƣơng pháp chuyển gen khác. Mở ra một hƣớng mới sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để biến nạp gen cho các mô đích khác nhau.
Sử dụng súng bắn gen
Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc của các hạt bọc DNA về phía tế bào thực vật. Nhờ có gia tốc lớn mà các hạt DNA có thể đâm xuyên qua thành tế bào và màng tế bào. Bên trong tế bào, DNA đƣợc phân tách từ các hạt nhỏ và tổng hợp ở trong hệ gen thực vật. Ƣu điểm của súng bắn gen là có thể loại bỏ các tác nhân sinh học không thích hợp, đặc biệt là với những loại mẫu không thích hợp với chuyển gen bằng vi khuẩn
Agrobacterium. Phƣơng pháp này cho phép chuyển trực tiếp gen quan tâm vào mô phân sinh đỉnh của thực vật. Tuy nhiên, phƣơng pháp này yêu cầu phải có dụng cụ, máy móc chuyên dụng có thể phân chia chính xác các hạt DNA sâu trong mô phân sinh đích. Báo cáo đầu tiên về chuyển gen bằng súng bắn gen vào đậu tƣơng sử dụng chồi phân sinh đỉnh làm mô đích đƣợc McCabe và cộng sự tiến hành năm 1988. Chồi đỉnh sau khi biến nạp đƣợc cảm ứng tạo đa chồi trƣớc khi tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Phân tích khối mô chuyển gen nhận thấy có các hạt nhỏ mang DNA và có sự tái tổ hợp DNA trong tế bào chủ [58]. Khả năng tổng hợp DNA trong tế bào đƣợc xem nhƣ biểu hiện của quá trình chuyển gen có hiệu quả.
Phương pháp biến nạp gen bằng xung điện
Sử dụng xung điện cho hiệu quả biến nạp khá cao đối với tế bào động vật. Fromm và cộng sự (1985) [52] lần đầu tiên cho rằng có thể cải tiến phƣơng pháp này để biến nạp gen vào thực vật. Năm 1985, nhóm tác giả đã sử dụng kỹ thuật xung điện để chuyển gen vào tế bào trần của cây ngô và họ đã thu đƣợc cây ngô chuyển gen bền vững bằng phƣơng pháp này [52]. Cùng với các thí nghiệm thu đƣợc trên cây thuốc lá của nhiều tác giả khác, phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng để chuyển gen cho cây đậu tƣơng.
Tế bào trần đậu tƣơng đƣợc xung điện đảm bảo mật độ 2-4 x 106
tế bào trên/ml môi trƣờng Kao bổ sung 40mM NaCl. Một mililít dung dịch huyền phù tế bào trần đƣợc hút cho vào cuvet 1,5ml và làm lạnh trong thời gian ngắn trên đá. Dòng điện
xung phát ra từ các sợi bạch kim có khoảng cách 1cm. Dòng điện này đƣợc cung cấp bởi một tụ điện 490 µF (Sprague Power- lytic 36D, Marsh Electronics, Milwaukee, WI) và là nguồn cung cấp điện áp ổn định. Điện thế đƣợc điều chỉnh bằng một vôn kế.
Chowrira và cộng sự (1995) [31] sử dụng phƣơng pháp xung điện để biến nạp gen vào điểm sinh trƣởng của cây mầm đậu tƣơng. Cây mầm 7-10 ngày đƣợc loại bỏ lá mầm, DNA đƣợc tiêm vào đỉnh chồi bằng hệ thống ống tiêm có chứa dung dịch lipofectin. DNA đƣợc chuyển vào bằng một dòng điện xung, cây sinh trƣởng mà không cần tác nhân chọn lọc. Quá trình này đã đƣợc thực hiện trên nhiều mô phân sinh và thu đƣợc một vài thể khảm. Đây là phƣơng pháp khá hay nhƣng việc ứng dụng còn nhiều hạn chế.
Phương pháp biến nạp gen qua ống phấn
Phƣơng pháp chuyển gen qua ống phấn phát triển một hệ thống chuyển gen độc lập với nuôi cấy mô tế bào đã giành đƣợc nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học. Cách tiếp cận này cho phép vƣợt qua rào cản về kiểu gen của cây biến nạp vốn ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Mặt khác chi phí tài chính và thời gian chọn tạo sẽ đƣợc rút ngắn. Phƣơng pháp chuyển gen qua ống phấn lần đầu tiên đƣợc báo cáo thành công trên cây bông, sau đó là một số cây trồng nhƣ ngô, lúa mì, cà chua. Một số báo cáo đã chỉ ra rằng có thể chuyển gen vào đậu tƣơng thông qua ống phấn [69]. Moore và cộng sự (1996) đã sử dụng phƣơng pháp này để tạo ra cây đậu tƣơng và cây bông chuyển gen. Nhóm tác giả đã thu đƣợc 50 hạt đậu tƣơng, 226 hạt bông, nhƣng tất cả đều cho kết quả âm tính khi sử lý thuốc diệt cỏ. Zenglu Li và cộng sự (2001) đã thu đƣợc xấp xỉ 5000 hạt đậu tƣơng sau khi xử lý hoa với DNA mang gen
bar. Khi kiểm tra tất cả các hạt thu đƣợc từ cây xử lý với DNA có chứa gen bar đều không cho kết quả dƣơng tính với gen này. Quan sát hình thái của một vài cây thấy có sự khác nhau, nhƣng hạt của chúng không có khả năng nảy mầm. Thí nghiệm khác với gen gus, nhóm tác giả thu đƣợc gần 2% số hạt của các cây đƣợc xử lý với DNA có chứa gen gus phản ứng dƣơng tính với gen này khi kiểm tra. Tuy nhiên, khi cho hạt nảy mầm và tiến hành lấy lá phân tích thì không thấy có sự hoạt động của gen gus. 3% hạt thu từ các cây thế hệ sau đƣợc kiểm tra đều không thấy có biểu hiện của gus. Huixia Shou và cộng sự (2002) [70] đã tiến hành chuyển gen vào 8 giống đậu tƣơng, trong đó có giống mô hình Williams 82 bằng kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn dựa trên phƣơng pháp của Liu và cộng sự (1992). Tuy nhiên kết quả đã không thành công nhƣ mong muốn. Nhiều báo cáo trƣớc đây khi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen này cũng đều chỉ ra những hạn chế của phƣơng pháp [69].
Chƣơng 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và thiết bị, dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
2.1.1. Vật liệu
Vật liệu thực vật: Thí nghiệm sử dụng các giống đậu tƣơng (ĐT 22, DT84, DT 2008) là các giống đậu tƣơng cho năng suất cao, đƣợc trồng phổ biến hiện nay, xuất xứ từ Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Thanh Trì, Hà Nội, hiện đang đƣợc lƣu giữ tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật. .
Các vật liệu khác:
- Vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: LBA4404, EHA105, GV3101.
- Plasmid: Thí nghiệm sử dụng vector nhị thể pX2-C1mpi:cry1B:nos mang 2 đoạn T- DNA. T-DNA thứ nhất đƣợc giới hạn bởi bờ trái AT LB (left Atum T-border) và bờ phải AT RB (right Atum T-border). Xen vào giữa hai bờ là gen chỉ thị gfp đƣợc điểu khiển bởi promoter gos2, gen chọn lọc thực vật hpt đƣợc điều khiển bởi promoter
CaMV35S. T-DNA thứ hai đƣợc giới hạn bởi bờ trái AR LB (left Arhiz T-border) và bờ phải AR RB (right Arhiz T-border), trên T- DNA thứ 2 này mang gen kháng sâu
cry1B đƣợc điều khiển bởi promoter C1mpi.- đây là loại promoter cảm ứng, chỉ hoạt động khi các tế báo bị tổn thƣơng
Nguồn gốc: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền nông nghiệp
- Primers: HptII-p-F 5'-acgccatgtagtgtattgaccgatt-3' HptII-p-R 5'-gaagtgcttgacattggggagttta-3' T-gfp-F 5‟-AAACGGCCACAAGTTCAGC-3‟ T-gfp-R 5‟-TTACTTGTACAGCTCGTCCA-3‟ T-cryIB-F1 5‟-CAACAACATCGACCCATTCG-3‟ T-cryIB-R1 5‟-CTGCGGAACTGGTTGTACCT-3‟
2.1.2. Thiết bị , dụng cụ và hóa chất thí nghiệm Hóa chất: Hóa chất:
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm có xuất xứ từ các hãng sản xuất Merk, Wako, Fermentas, Sigma (phụ lục ) và các môi trƣờng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm gồm: LB, BGM, IM, CCM, WS, SIM I, SIM II, SEM I, SEM II, SEMIII, SEMIV, RM (Thành phần xem phụ lục)
Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:
- Tủ lạnh lƣu giữ mẫu và hóa chất: Tủ – 80oC (Sanyo MDF – U3086S), tủ – 20oC (Sanyo MDF – U333), tủ – 4oC (Sanyo MPR – 311D).
- Các thiết bị, dụng cụ phục vụ thí nghiệm: Máy lắc ổn nhiệt 28oC/37oC (Innova 4230), cân điện tử (Sartonicus / CP224S), tủ cấy vô trùng cấp II (ESCO – EQR/GL 05), máy li tâm lạnh (Eppendorf - 5810R), máy hút chân không (Eppendorf Concentrator – 5310), bể nƣớc ổn nhiệt (Transsonic – T660/H), máy nhân gen (Gene Amp PCR system 9700/ Applied Biolosystems), bộ pipette (Thermo CH 23076), máy khử trùng (ASV – 2402), bộ điện di (PAC 200 – Bio-RAD), máy soi gel (B-2300 TVRN Hout), bình Schoff (250 ml, 500ml, 1000 ml), bình tam giác (100 ml, 250 ml), đĩa petri, que cấy khuẩn hoặc que chang, dao và panh, đèn cồn....
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu tƣơng nghiên cứu, lựa chọn giống làm vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen.
- Chọn chủng vi khuẩn Agrobacterium tumeficens phù hợp cho chuyển gen vào giống đậu tƣơng nghiên cứu.
- Tối ƣu hóa một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp ở giống đậu tƣơng nghiên cứu.
- Đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry1B vào một số dòng/giống đậu tƣơng Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumeficens mang hệ thống vector pX2- C1mpi:Cry1B:nos.
- Xác định sự có mặt của gen kháng sâu cry1B và gen chọn lọc hpt (kháng kháng sinh) ở các dòng đậu tƣơng chuyển gen.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Chuẩn bị tế bào khả biến 2.3.1. Chuẩn bị tế bào khả biến
Tế bào khả biến đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp của McCormac 1998, có cải tiến: Chủng khuẩn đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc nuôi ở nhiệt độ thích hợp (vi khuẩn A.tumefaciens - 280C), qua đêm. Sau đó, lấy một khuẩn lạc đơn vào 3ml môi trƣờng LB lỏng, lắc 200vòng/phút, nuôi qua đêm. Chuyển 0,5ml dịch sang 50ml môi trƣờng LB lỏng, lắc 200vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp, khi nồng độ vi khuẩn đạt OD = 0,6 – 0,8 tiến hành chuyển sang ống ly tâm lạnh. Ly tâm, 6000vòng/phút trong 10