Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng

(1) Chuẩn bị Agrobaterium

Chủng vi khuẩn Agrobaterium chọn lọc đã có plasmid vector pX2- C1mpi:Cry1B:nos mang gen kháng côn trùng cryIB và chỉ thị chọn lọc hpt, gen chỉ thị sàng lọc gfp. Trƣớc khi biến nạp, chủng vi khuẩn A. tumefaciens từ nguồn lƣu giữ đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l để chọn đƣợc những khuẩn lạc mang vector pX2-C1mpi:Cry1B:nos. Lấy 2 khuẩn lạc đơn từ đĩa nuôi trong 50 ml LB lỏng có bổ sung kanamycin 50mg/l, nuôi lắc qua đêm ở 250

C, 120 vòng/phút để việc chọn lọc khuẩn mang vector PX2-C1mpi : Cry1B :nos tốt hơn. Mật độ vi khuẩn đƣợc xác định bằng máy quang phổ khả kiến ở bƣớc sóng 600nm (OD₆₀₀). Một giờ trƣớc khi biến nạp, ly tâm dịch khuẩn ở 4.000 vòng/phút, 40

C trong 10 phút để thu cặn tế bào. Cặn tế bào đƣợc làm loãng trong dung dịch CCM lỏng (Phụ lục), nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C khoảng 40-60 phút trƣớc khi biến nạp.

(2)Chuẩn bị mẫu đậu tương cho biến nạp: Mẫu đậu tƣơng đƣợc chuẩn bị giống mục 2.3.6

(3) Biến nạp: Biến nạp bao gồm bƣớc gây tổn thƣơng và xâm nhiễm, đồng nuôi cấy.

Gây tổn thƣơng mẫu đƣợc tiến hành tƣơng tự mục 2.3.6 với các phƣơng thức lây nhiễm ở thí nghiệm 4 , mỗi nửa nốt lá mầm sau khi gây tổn thƣơng chuyển qua bình tam giác chứa môi trƣờng lây nhiễm lắc nhẹ 70-80 vòng/phút trong khoảng thời gian lây nhiễm khác nhau ở thí nghiệm 5 để tiếp tục quá trình lây nhiễm. Nuôi cấy mẫu trên môi trƣờng đồng nuôi cấy CCM (Phụ lục II), thời gian đồng nuôi cấy đƣợc bố trí nhƣ thí nghiệm 6, trong tối ở 250

C.

(4) Chọn lọc và tái sinh

Sau đồng nuôi cấy, mẫu lây nhiễm đƣợc rửa trong dung dịch SIM I lỏng có bổ sung cefotaxim 200mg/l (Phụ lục II) với thời gian rửa 1 giờ. Mẫu lây nhiễm đƣợc nuôi cấy tái sinh trên môi trƣờng SIM I đặc để tái sinh chồi 2 tuần trong điều kiện chiếu sáng 18h/ngày, nhiệt độ 25⁰C. Sau khi có chồi xuất hiện, tiến hành cắt bỏ toàn bộ phần lá mầm, chuyển chồi hình thành sang môi trƣờng SIM II chứa hygromycin ở các nồng độ khác nhau ở thí nghiệm 8 để chọn lọc chồi chuyển gen. Thời gian chọn lọc khoảng 2 tuần ở 250C, chiếu sáng 18h/ngày. Chồi sống sót sau 2 tuần chọn lọc chuyển sang môi trƣờng SEM để kéo dài chồi.

(5) Giai đoạn kéo dài chồi, tạo rễ và đưa cây ra trồng tiến hành tương tự mục 2.3.6

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình biến nạp và tái sinh cây đậu tƣơng từ nốt lá mầm