Sau khi có kết quả đánh giá khả năng tái sinh của 3 giống đậu tƣơng nghiên cứu, ĐT22 đƣợc chọn là giống đậu tƣơng sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen. Chúng tôi tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nốt lá mầm giống đậu tƣơng ĐT22 với 2 chủng vi
khuẩn Agrobacterium: LBA4404, EHA105 mang vector nhị thể pX2 chứa gen chỉ thị
gfp với mục đích lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen ở giống ĐT22. Kết quả thu đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
. Cây hai lá mầm đƣợc xem là vật chủ tự nhiên của Agrobacterium và phƣơng pháp chuyển gen trên đối tƣợng này nhờ vi khuẩn A.tumefaciens đƣợc đánh giá là hiệu quả nhất. Nhƣng đậu tƣơng là cây rất khó tính đối với sự xâm nhập của vi khuẩn, cho tới nay ngƣời ta mới chỉ tìm ra một số chủng Agrobacterium mẫm cảm với đậu tƣơng [66].
Theo đánh giá kết quả nghiên cứu sự tƣơng thích của 2 chủng khuẩn EHA105 và LBA 4404 mang vector pX2-C1mpi:Cry1B:nos với đậu tƣơng ĐT 22, thấy rằng, EHA105 cho hiệu quả biến nạp gen tạm thời tƣơng đối cao (1,05 %) so với LBA4404 . Các thí nghiệm với chủng vi khuẩn GV3101 chƣa thấy có biểu hiện tạm thời của gen chỉ thị sàng lọc gfp. Nhƣ vậy, có thể kết luận, chủng khuẩn EHA105 phù hợp cho chuyển nạp gen vào đậu tƣơng ĐT 22.
Hình 3.3. Biểu hiện gfp ở đậu tƣơng ĐT22 khi đƣợc lây nhiễm với chủng vi khuẩn Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen ở đậu tƣơng
Chủng vi
khuẩn biến nạp Số mẫu Số mẫu sống (mẫu) quan sát Số chồi
Số chồi biểu hiện GFP Mức độ biểu hiện (%) EHA105 100 73 287 3 1,05 LBA 4404 100 75 292 1 0,34 GV3101 100 72 291 0 0
Các nghiên cứu trƣớc đây đã đƣa ra một số chủng Agrobacterium khác nhau có khả năng xâm nhiễm hiệu quả vào nốt lá mầm của các giống đậu tƣơng. Năm 1989 Parrott và cộng sự lần đầu tiên sử dụng chủng vi khuẩn LBA4404 và EHA101 để biến nạp gen vào 15 giống đậu tƣơng khác nhau. Ông so sánh hiệu quả biến nạp và nhận thấy ở một số giống cho hiệu quả cao khi sử dụng chủng EHA101. Một số giống khác
lại thích ứng với chủng LBA4404. Tiếp đến, Olhoft và cộng sự (2003) cũng đã thành công khi biến nạp chủng LBA4404 mang vector nhị thể pTOK233 với nốt lá mầm giống đậu tƣơng „Bert‟; Hai-Kun Liu và cộng sự (2004) [59] sử dụng chủng vi khuẩn EHA105 để biến nạp vào đỉnh phôi của các giống đậu tƣơng Hefeng 35, Dongnong 42, và Hefeng 39 cho hiệu quả tƣơng đối cao. Sau đó có nhiều nhà khoa học sử dụng chủng vi khuẩn này để biến nạp gen vào đậu tƣơng nhƣ Xinping YI và Deyue YU (2006), Sheng-Jun Liu và cộng sự (2008) . Tran Thi Cuc Hoa và cộng sự (2008) cũng đã thu đƣợc cây chuyển gen tái sinh khi biến nạp chủng EHA101 mang vetor pZY102 vào nốt lá mầm giống đậu tƣơng PC19. Nhƣng cho tới nay hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở đậu tƣơng còn tƣơng đối thấp, ngƣời ta vẫn chƣa tìm ra đƣợc một chủng hay một vector nào thích hợp có thể sử dụng để biến nạp vào tất cả các giống đậu tƣơng. Điều này phản ánh tính phức tạp trong mối tƣơng tác giữa
Agrobacterium và thực vật.
3.4.Tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen
Từ kết quả đánh giá khả năng tái sinh và tạo đa chồi invitro của 3 giống đậu tƣơng ĐT22, DT2008, DT84 trong khóa luận này và kết quả bƣớc đầu trong nghiên cứu chuyển gen kháng sâu Cry1B ở 3 giống ĐT22, DT96, ĐT26 của Nguyễn Văn Đồng và công sự 2012, chúng tôi đã chọn giống đậu tƣơng ĐT22 và chủng khuẩn EHA105 để tiếp tục các thí nghiệm tối ƣu hóa quá trình chuyển gen Cry1B, nhằm nâng cao hiệu quả biến nạp ở giống đậu tƣơng ĐT 22. Hai giống đậu tƣơng DT2008 và DT84 là hai giống chịu hạn cần đƣợc tiến hành các nghiên cứu cải tiến phƣơng pháp tái sinh – tạo đa chồi thích hợp để có thể làm nguồn vật liệu tối ƣu cho nghiên cứu tạo giống đậu tƣơng có nhiều đặc tính tốt, đồng thời có thể chịu hạn và mang tính kháng sâu.
Các vector đƣợc thiết kế với các kích thƣớc khác nhau và độ lớn của các vector chuyển gen ảnh hƣởng đến khả năng chuyển T-DNA sang tế bào thực vật. Vector pX2 - C1mpi:Cry1B:nos mang gen chỉ thị sàng lọc gfp, vì vậy trong khóa luận này chúng tôi sử dụng chính vector mục tiêu này để nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp nạp gen, tăng cƣờng mức độ chính xác và giản lƣợc thời gian của quá trình nghiên cứu.
3.4.1.Ảnh hưởng của mật dộ tế bào vi khuẩn lây nhiễm
Một trong những yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium chính là mật độ của vi khuẩn khi lây nhiễm. Mật độ vi khuẩn thể hiện số tế bào vi khuẩn trong một đơn vị thể tích, khi lƣợng tế bào vi khuẩn quá thấp sẽ làm giảm tần số tiếp xúc với các mẫu thực vật do đó hiệu quả biến nạp không cao; ngƣợc lại, khi lƣợng tế bào vi khuẩn quá cao ảnh hƣởng tới sự phát triển của mẫu thực vật, thậm chí làm chết mẫu trong quá trình nuôi cấy. C. A. Meurer và cộng sự (1998) [24] đã sử dụng chủng vi khuẩn EHA105 với mật độ OD=1,0 để lây nhiễm với
nốt lá mầm của 28 giống đậu tƣơng khác nhau cho kết quả cao. Năm 2001, 2003, Olhoft và công sự đã sử dụng nồng độ dịch khuẩn OD600 = 0,8-1,0 khi tiến hành lây nhiễm với nốt lá mầm đậu tƣơng và thu đƣợc tần số biểu hiện tạm thời của gen GUS
lên đến 83,3%. Các kết quả nghiên cứu khác cũng cho kết quả tƣơng tự [8]. Mục đích của nghiên cứu này là xác định mật độ vi khuẩn (OD600) thích hợp cho quá trình biến nạp để sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium đạt hiệu quả nhất.
Thí nghiệm tiến hành thử nghiệm các nồng độ vi khuẩn khác nhau: OD600= 0,0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1; 1,2; 1,3 của chủng vi khuẩn EHA105. Tổng số mẫu lây nhiễm tƣơng ứng với mỗi công thức là 100 mảnh lá mầm của giống đậu tƣơng ĐT22. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen
OD600 Số mẫu biến nạp Số mẫu sống (mẫu) Số chồi quan sát Số chồi biểu hiện GFP
Hiệu quả biến nạp (%) 0,0 100 100 (100%) 395 0 0,00 0,3 100 100 (100%) 392 2 0,51 0,5 100 100 (100%) 393 5 1,27 0,7 100 99 (99%) 390 6 1,54 0,9 100 86 (86%) 337 3 0.89 1,1 100 87 (87%) 338 2 0,59 1,2 100 59 (59%) 226 2 0,88 1,3 100 48 (48%) 182 1 0,55
Kết quả cho thấy: Mật độ vi khuẩn ảnh hƣởng rõ rệt đến tần số chuyển gen cũng nhƣ tỷ lệ sống của mẫu. Ở nồng độ OD thấp hơn 0,5 (từ 0 đến 0,3) tỷ lệ mẫu sống sau giai đoạn đồng nuôi cấy đạt 100%, mẫu biến nạp hầu nhƣ không bị ảnh hƣởng bởi nồng độ dịch khuẩn. Tuy nhiên, ở nồng độ này tỷ lệ mẫu biến nạp tƣơng đồi thấp (0 %-0,51%). Khi nồng độ dịch khuẩn đạt từ trên 0,5 – 0,7, với thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày, mẫu có biểu hiện bị chết do mật độ khuẩn dày đặc. Tỷ lệ mẫu chết tăng đáng kể khi mật độ vi khuẩn đạt trên 0,9 (tỷ lệ mẫu sống giảm từ 99% ở OD= 0,5 xuống 86% khi OD=0,9). Về hiệu quả biến nạp, ở khoảng nồng độ OD = 0,5-0,7 hiệu quả biến nạp có dấu hiệu tăng từ 1,27 đến 1,54%. Khi mật độ vi khuẩn đạt 1,2 - 1,3 tỷ lệ mẫu chết tƣơng đối cao (41% - 52%) do đó đã ảnh hƣởng lớn đến hiệu quả biến nạp gen (hiệu quả biến nạp gen đạt 0,94 và 0,50%). Nhƣ vậy, từ kết quả thí nghiệm trên có thể sử dụng giá trị OD dao động từ 0,5 – 0,7 khi biến nạp gen thông qua Agrobacterium chủng EHA105 vào giống đậu tƣơng ĐT22.