2.3.9.1. Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh
TN1: Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương nghiên cứu, lựa chọn giống làm vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen
- Tiến hành: 3 giống đậu tƣơng của Việt Nam (ĐT22, DT2008 và DT84) đƣợc tiến hành nuôi cấy tái sinh theo quy trình hình 2.1. Mỗi giống sử dụng 100 hạt, ở môi trƣờng nuôi cấy nảy mầm BGM: 12 – 14 hạt/đĩa petri, ở môi trƣờng nảy chồi SIM I: 5 mẫu/đĩa petri. Chồi đƣợc kéo dài trên môi trƣờng SEM và tạo rễ trên môi trƣờng RM. Thí nghiệm tiến hành nhắc lại 3 lần.
- Đánh giá: Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh dựa trên các chỉ tiêu: Phần trăm sống sót, tỉ lệ tạo đa chồi, chiều dài chồi và rễ. Giống thích hợp sẽ đƣợc sử dụng làm vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.3.9.2. Đánh giá sự tương thích giữa chủng khuẩn và giống đậu tương
TN2: Xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với giống đậu tương chọn lọc
Sử dụng 3 chủng vi khuẩn EHA105, LBA4404, GV3102 chứa vector nhị thể pX2-C1mpi:cry1B:nos để biến nạp vào 1 trong 3 giống đậu tƣơng đƣợc lựa chọn ở TN1. Hiệu quả biến nạp gen đƣợc đánh giá thông qua biểu hiện tạm thời của gen gfp. Chủng vi khuẩn đƣợc chọn lọc ở sẽ sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
2.3.9.3. Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen
TN3: Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp
Vector nhị thể pX2-C1mpi:cry1B:nos đƣợc biến nạp vào chủng vi khuẩn thích hợp và đƣợc sử dụng cho thí nghiệm. Nuôi lắc chủng vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh thích hợp và xác định nồng độ (OD650) bằng máy đo quang phổ kế. Thí nghiệm tiến hành ở các nồng độ OD: 0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1; 1,2. Nồng độ OD thích hợp đƣợc xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp.
TN4: Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm
Mẫu đƣợc gây tổn thƣơng và lây nhiễm trên 4 phƣơng thức: gây tổn thƣơng trong môi trƣờng nƣớc, dịch khuẩn (LB lỏng), môi trƣờng lây nhiễm lỏng (IM), gây tổn thƣơng trên đĩa sạch khô. Phƣơng thức thích hợp đƣợc đánh giá bằng phần trăm sống sót và hiệu quả biểu hiện gfp.
TN5: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm
Tiến hành lây nhiễm mẫu với vi khuẩn trong các khoảng thời gian khác nhau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ
TN6: Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp
Tiến hành thử nghiệm đồng nuôi cấy mẫu trên môi trƣờng cộng sinh của vi khuẩn ở các thời gian: 0 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp đƣợc xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
TN7: Ảnh hưởng của nồng độ chất dẫn dụ Acetosyringon (AS) đến hiệu quả biến nạp gen.
Đánh giá ảnh hƣởng của chất AS ở các nồng độ 0,00 mg/l; 20mg/l; 40mg/l; 80mg/l; 100mg/l; 120mg/l. Nồng độ AS thích hợp đƣợc xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
TN8: Ảnh hưởng của hygromycin đến hiệu quả chọn lọc sau chuyển gen
Đánh giá ảnh hƣởng của hygromycin ở các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25mg/l. Nồng độ hygomycin thích hợp đƣợc xác định bằng tỷ lệ chọn lọc cá thể chuyển gen
2.3.9.4. Đánh giá hiệu quả chuyển gen cry1B ở giống đậu tƣơng chọn lọc
Thực hiện thí nghiệm chuyển gen dựa trên các yếu tố tối ƣu ở mục 2.3.9.2 vào giống đậu tƣơng chọn lọc. DNA tổng số của mẫu lá của các dòng đậu tƣơng T0 đƣợc tách chiết và kiểm tra chất lƣợng DNA và tiến hành PCR gen cry1B. Hiệu quả biến nạp đƣợc xác định thông qua sự có mặt của gen cry1B.
2.3.9.5. Xác định sự có mặt của gen cry1B và gen chọn lọc hpt ( kháng kháng sinh) ở các dòng đậu tƣơng chuyển gen T1
Các cây đậu tƣơng T0 sau khi thu hoạch, hạt T1 đƣợc gieo trồng, thu mẫu lá, tách DNA tổng số và đánh giá sự phân ly của gen cry1B và gen chọn lọc hpt (kháng kháng sinh) thông qua kiểm tra PCR