- Khử trùng hạt:Hạt đƣợc khử trùng theo quy trình khử trùng hạt của Xue R.G. et al. (2006) đã cải tiến và đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng: Ngâm hạt với nƣớc cất vô trùng trong 30 phút. Sau khi loại bỏ nƣớc, lắc hạt với ethanol 70% trong 3 phút, rửa hạt bằng nƣớc cất vô trùng 1 lần. Thêm hạt với NaClO 15%, trong thời gian 12 phút. Rửa hạt bằng nƣớc cất vô trùng 3-4 lần (rửa đến khi hết bọt). Các dung dịch khử
trùng có khả năng xâm nhập và len lỏi vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt hạt đậu để có thể khử sạch hạt khỏi nấm và vi khuẩn (bởi vì hạt đậu tƣơng đƣợc thu hoạch từ đồng ruộng nên chứa nhiều các loại vi khuẩn và nấm).
- Nuôi cấy nảy mầm hạt: Hạt sau khi đã đƣợc khử trùng, đƣa ra đĩa petri, dùng dao số 11 và panh tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt. Đƣa hạt ra đĩa petri, dùng dao số 11 tách bỏ vỏ ngoài và nuôi cấy nảy mầm hạt trên môi trƣờng nảy chồi BGM.
- Nuôi cấy nảy chồi: Mẫu dùng để nuôi cấy nảy chồi và thao tác gây tổn thƣơng trên mẫu đồng thời đƣợc sử dụng trong biến nạp, áp dụng phƣơng pháp của Olhoft P.M. và cộng sự (2003), Paz.et al (2006), Xue R.G. et al (2006) với một số cải tiến. Nốt lá mầm sau nảy mầm 3-5 ngày đƣợc dùng làm vật liệu. Quy trình: Hạt đậu tƣơng sau nảy mầm 3-5 ngày đƣợc loại bỏ một phần trụ dƣới lá mầm, phần còn lại dài 2-3 mm. Dùng dao tách đôi hai lá mầm, sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh. Các mẫu nuôi cấy này đƣợc cắt bỏ chồi đỉnh và gây tổn thƣơng xung quanh mặt trong nốt lá mầm 12-14 vết thƣơng/mẫu, sâu 0,5 mm bằng mũi dao. Sau khi gây tổn thƣơng, mẫu nuôi cấy đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung BAP 1,5mg/l (phụ lục II) để kích thích khả năng tái sinh tạo đa chồi. Điều kiện chiếu sáng 18h/ngày, ở 250
C.
- Kéo dài chồi: Tách riêng biệt các chồi từ cụm chồi thu đƣợc chuyển sang môi
trƣờng kéo dài (SEM) có bổ sung GA3 (phụ lục II ). Nuôi 4 tuần ở chế độ 250C, với 18/6h sáng/tối trong tủ nuôi cây.
- Ra rễ: Khi chồi phát triển có chiều dài khoảng trên 4 cm đƣợc chuyển sang môi trƣờng tạo rễ RM (phụ lục II) nuôi sáng ở 250
C, thời gian từ 2-3 tuần.
- Chuyển cây ra bầu đất: Cây tái sinh trên môi trƣờng RM có 3-4 rễ, cao 5-7 cm đƣợc chuyển ra trồng trên bầu đất, tƣới nƣớc thƣờng xuyên với lƣợng vừa đủ, tránh úng.
Hạt đậu tƣơng
Khử trùng
Nuôi cấy nảy mầm
Gây tổn thƣơng Nuôi cấy nảy chồi
Tách cụm chồi Kéo dài chồi
Ra rễ
Ra cây
