khuẩn để biến nạp vào đậu tƣơng
Vector pX2-C1mpi:Cry1B:nos là một vector nhị thể mang 2 đoạn T-DNA. T- DNA thứ nhất đƣợc giới hạn bởi bờ trái AT LB (left Atum T-border) và bờ phải AT RB (right Atum T-border). Xen vào giữa hai bờ là gen chỉ thị gfp đƣợc điểu khiển bởi promoter gos2, gen chọn lọc thực vật hpt đƣợc điều khiển bởi promoter CaMV35S. T- DNA thứ hai đƣợc giới hạn bởi bờ trái AR LB (left Arhiz T-border) và bờ phải AR RB (right Arhiz T-border), trên T- DNA thứ 2 này mang gen kháng sâu cry1B đƣợc điều khiển bởi promoter C1mpi. Hai đoạn T-DNA này sẽ phân ly ở thế hệ thứ hai trở đi. Do vậy, có thể chọn lọc dòng đậu tƣơng chuyển gen kháng sâu và không mang gen kháng kháng sinh. Tạo cây đậu tƣơng mang tính an toàn sinh học cao.
Hệ thống plasmid vector pX2-C1mpi:Cry1B:nos đƣợc biến nạp vào vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens chủng EHA105 và LBA4404 bằng phƣơng pháp xung điện. Sau khi điện xung, dịch khuẩn đƣợc nuôi cấy chọn lọc khuẩn lạc trên môi trƣờng chứa 50mg/l kanamycin. Sau 48-72h nuôi cấy ở 280C, trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng, hình tròn. Lựa chọn trên mỗi đĩa nuôi cấy vi khuẩn chủng EHA105, GV3101 và LBA4404 2 khuẩn lạc dƣơng tính trên môi trƣờng chọn lọc, tách plasmid và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi gfp.
Hình 3.1: Mẫu biến nạp plasmid pX2-C1mpi:Cry1B:nos trong Agrobacterium
chủng EHA 105
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy đƣợc thể hiện trên hình 3.2:
Đối với chủng LBA4404: trong 2 khuẩn lạc đƣợc kiểm tra có khuẩn lạc số 3 không xuất hiện băng vạch, khuẩn lạc còn lại xuất hiện băng vạch 600bp trên bản điện
di phù hợp với đoạn gfp. Đối với chủng EHA105, GV3101: Các khuẩn lạc đều xuất hiện băng vạch với kích thƣớc (600bp) phù hợp với đoạn gen gfp. Những khuẩn lạc này đƣợc nuôi lỏng trên môi trƣờng LB lỏng có bổ sung 50mg/l kanamycin để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
