DNA đƣợc tách chiết và tinh sạch bằng phƣơng pháp CTAB của Saghai Maroof (1984), có cải tiến.
Hóa chất:
-Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam
- -Mercapto ethanol : 250 l
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml
- NaCl 5M : 30 ml - Tris HCl 8,0 : 15 ml - H2O : 55 ml - Đệm TE EDTA pH 8,0 gồm: - Tris HCl 8,0 : 10 mM - EDTA 8,0 : 1 mM - Enzyme Rnase: 10 g/ml - Cồn tuyệt đối lạnh - NaCl 5 M
- Dung dịch (24:1) gồm Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 24/1.
- Dung dịch (25:24:1) gồm Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 25/24/1. - Dung dịch rửa là cồn 75%.
Quy trình:
- Nghiền 0,3 - 0,5 gam lá đậu tƣơng trong nitơ lỏng thành bột mịn.
- Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút.
- Ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhƣng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại 2 lần).
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ rồi 20 trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5 l NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm.
- Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
- Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (thực hiện 2 lần). - Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (5 phút).
- Bố sung 30 l H2O + 1 l RNAse sau đó ủ ở 370C trong 30 phút. Đem cất giữ ở -200
C.
