(Nguồn: Tài liệu Công ty Deasung Thái Lan, 2001) Nước thải Nước thải Lột vỏ Củ sắn Rửa Cắt Mài Tách chiết Ly tâm Tách nước Sấy Thu hồi tinh bột
N
ước t
hả
i
Đóng gói
Nước Nước thải
Dung dịch sulfit
29 Quy trình sản xuất tinh bột ngơ
Hình 1.17. Sơ đồ quy trình sản xuất tinh bột ngơ
(Nguồn: Bùi Đức Hợi và cộng sự, 2007)
Quy trình sản xuất tinh gồm các giai đoạn sau
Ngâm hạt để làm thay đổi cấu trúc, giảm độ bền vững và giải thoát phần lớn chất hòa tan vào nước ngâm. Đập hạt đã ngâm để phá hủy liên kết giữa phôi và các phân tử khác của hạt. Tách phơi. Nghiền mịn nhằm giải phóng tinh bột khỏi tế bào nội nhũ. Rây dịch tách các phần tử tinh bột và protein khỏi phôi và bã. Phân ly dịch tinh bột và protein tách riêng tinh bột và gluten. Rửa tinh bột để tách
Ngâm Ngô Đập mảnh Tách phôi Sàng cháo Nghiền mịn cháo Tách bã Tách gluten Tinh bột ướt Rửa tinh bột Nước sạch
Nước Nước thải
Bã
Bã
30
triệt để các hợp chất hòa tan. Cuối cùng được tinh bột ướt cho sản xuất mật tinh bột, glucose, tinh bột khô và các chế phẩm khác. Phôi để ép dầu, bã làm thức ăn gia súc, dịch ngâm để sản xuất chất kháng sinh hay thức ăn gia súc sau khi đã làm bay hơi (Bùi Đức Hợi và cộng sự, 2007).
1.2.1.2. Tổng quan các phương pháp làm giàu RS và kiểm nghiệm các chỉ số.
Phương pháp vật lý
Phương pháp vật lý được sử dụng rất phổ biến để làm giàu RS bởi vì tính an tồn và kinh tế của chúng. Tác động của nhiệt và ẩm đã được nghiên cứu và chứng minh có ảnh hưởng đến sự hình thành RS, nên một số phương pháp biến tính sử dụng nhiệt và ẩm được nghiên cứu. Và đây là hai phương pháp được đề cập đến: xử lý nhiệt ẩm (Heat-moisture treatment - HMT) và xử lý ẩm nhiệt (Annealing -ANN). Đây là hai phương pháp biến tính tinh bột bằng vật lý làm thay đổi tính chất lý hóa của tinh bột nhưng khơng làm thay đổi cấu trúc hạt tinh bột (Adebowale và cộng sự, 2005; Hormdok, 2007; Jacobs, 1998; Maache- Rezzoug và cộng sự, 2008). Cả hai phương pháp đều cần phải kiểm soát độ ẩm của tinh bột, nhiệt độ và thời gian xử lý (Chung, Liu và Hoover, 2009). Tuy nhiên hai phương pháp này yêu cầu lượng nước, nhiệt độ và thời gian xử lý khác nhau. HMT được thực hiện trong điều kiện ẩm giới hạn (10–30%) và khoảng nhiệt độ cao hơn (90–1200C), trong khi đó ANN thì u cầu hàm lượng nước cao hơn (50– 60%) và xử lý ở nhiệt độ thấp dưới nhiệt độ hồ hóa (Maache Rezzougetal, 2008).
A. Gunaratne và R. Hoover (2001) đã sử dụng phương pháp này trên tinh bột một số loại củ như: khoai tây, sắn, khoai môn, khoai mỡ (100oC trong 10 giờ với độ ẩm 30%). Các hạt tinh bột ban đầu có hình trịn, hình bầu dục và đa giác với bề mặt nhẵn. Kích thước hạt (đường kính) dao động 3,0-110 µm, hàm lượng amylose dao động 22,4-29,3%. Qua mơ hình X-ray, tinh bột khoai tây và khoai mỡ là kết tinh loại B, khoai môn là kết tinh loại A, khoai mỳ là kết tinh loại C. Kết quả cho thấy chỉ có sự thay đổi với các tinh bột có kết tinh loại B. Qua mơ hình X-ray của tinh bột, tinh thể loại B đã bị thay đổi sang tinh thể loại C. Ratnajothi Hoover (1993) cũng thu kết quả tương tự khi thực hiên trên tinh bột
31
lúa mỳ, yến mạch, đậu lăng. Phạm Văn Hùng và cộng sự (2014) cho thấy rằng hàm lượng RS khoai lang (14.75%) và khoai mỡ (21.6%) tăng lên tới 27.2% đối với khoai lang và 31% đối với khoai mỡ khi xử lí nhiệt ẩm.
Ngoài phương pháp nhiệt - ẩm, các nhà nghiên cứu cũng đã áp dụng một số phương pháp khác để làm giàu RS trong tinh bột như hấp và thối hóa theo chu kỳ (Autoclaving and retrogradation cycles), Áp lực thủy tĩnh cao (High hydrostatic pressure), Ép đùn (Extrusion), Xử lý bằng chiếu xạ (γ-Irradiation Treatment), Sử dụng sóng siêu âm (ultrasound waves).
Phương pháp hóa học
RS4 là tinh bột kháng enzyme được tạo ra bằng cách tạo liên kết ngang với các tác nhân hóa học (Haynes và những người khác 2000). Tinh bột liên kết ngang thu được từ phản ứng của tinh bột với tác nhân hóa học như: sodium trimetaphosphate, phosphorus oxychloride, hoặc hỗn hợp anhydrides của acid acetic acid và acid dicarboxylic. Liên kết ngang được thực hiện bởi nhóm sulphonate và phosphate giữa các phân tử tinh bột khác nhau liên quan đến nhóm hydroxyl. Do đó mang lại khả năng chống tấn công phân giải tinh bột trên phân tử tinh bột (Hamilton và Paschall 1967). RS từ tinh bột ngơ amylose cao qua q trình hấp, làm nguội và thủy phân axit được thực hiện bởi Xin-Huai Zhao (2009). Kết quả thí nghiệm cho thấy, tinh bột ngơ amylose cao thủy phân với 0,1 M acid citric ở nhiệt độ phòng trong 12 h làm tăng RS đến 39%. Tuy nhiên, tinh bột sử dụng phương pháp này đặc tính sinh học khơng cao, chủ yếu dùng làm phụ gia. Với phương pháp nhiệt ẩm, phân cắt enzyme thì ngược lại, RS thu được mang tính sinh học cao, an tồn, hàm lượng RS cao hơn, có thể sử dụng dưới dạng thực phẩm chức năng.
Phương pháp xử lý bằng enzyme (Enzymeatic Treatments).
Nguyên tắc: dựa trên sự thủy phân đặc hiệu của những enzyme cắt liên kết 1-6 glycoside và 1-4 glycoside mà mạch tinh bột được cắt nhỏ ở một mức độ có kiểm sốt, số lượng mạch amylose gia tăng sau đó làm tăng khả năng kết tinh của hạt, làm cơ sở của việc kháng enzyme tiêu hóa.
32
Sử dụng phương pháp xử lý enzyme, RS chủ yếu được tăng bằng cách tăng rõ ràng mức độ của amylose qua việc các phân tử amylopectin bị bẻ nhánh. Sau sự thối hóa, điều này sẽ cho phép các amylose hình thành nhiều hơn cấu trúc tinh thể được đóng gói chặt chẽ, điều đó sẽ gây khó khăn cho các enzyme thủy phân. Thông thường việc bẻ nhánh là nhờ enzyme pullulanase hoặc isoamylase, cả hai loại này đều có tác động tích cực trong việc làm tăng RS.
Cả hai pullulanase và isoamylase tác dụng đặc hiệu trên liên kết α- (1,6) glycoside được tìm thấy tại các điểm của mạch nhánh trên các phân tử amylopectin, do đó làm tăng hàm lượng amylose một cách rõ ràng trong khi vẫn duy trì một tổng lượng tinh bột cố định. Các enzyme khác như α-amylase và β- amylase cũng có thể được sử dụng; Tuy nhiên, chúng khơng có vai trị bẻ nhánh, mà thay vào đó, α-amylase tác động tùy tiện trên tất cả các liên kết α-(1-4) glycoside ngoại trừ những điểm phân nhánh gần với liên kết này, do vậy sản phẩm tạo ra là những monome glucose. β-amylase cũng chỉ tác động trên liên kết α- (1,4) glycoside từ đầu không khử của phân tử amylopectin hoặc amylose, sản phẩm chủ yếu là đường maltose. Điều này sẽ gây ra q trình thủy phân hồn tồn mạch amylose và các mạch nhánh bên ngoài của amylopectin. Các enzyme này (α- amylase và β-amylase) có thể được sử dụng để thủy phân vùng vơ định hình trong các hạt tinh bột, để tạo ra sau đó là các tinh thể được đóng gói chặt chẽ, mà nhiều khả năng có thể chống được q trình tiêu hóa (hình 1.18).
33
Vì mục đích của xử lý bằng enzyme với tinh bột thường để thủy phân các mạch nhánh của amylopectin mà không phải là amylose, do vậy pullulanase và isoamylase được sử dụng phổ biến hơn. Do đó, khi tinh bột được trải qua bẻ nhánh bằng enzyme, hàm lượng và cấu trúc amylopectin sẽ ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng RS. Khi quá trình bẻ nhánh được thực hiện, hàm lượng amylose sẽ tăng lên, mà khi thối hóa sẽ tạo ra mức RS cao hơn do amylose hình thành các tinh thể được đóng gói chặt chẽ (RS3), dẫn đến sự gia tăng tổng thể về mức độ tinh thể (Li và cộng sự, 2011).
Ngồi ra, các sợi amylose có thể tổ chức lại để tạo thành xoắn kép ổn định bằng liên kết hydro, có thể dẫn đến sự hình thành thêm các RS3. Mặc dù có những nghiên cứu khẳng định về việc tăng hàm lượng amylose trong tinh bột từ một số nguồn thực vật được cho là có biểu hiện đến sự tăng lên của tinh thể (Li và cộng sự, 2011), nhung khơng phải xu hướng đó tồn tại trong tinh bột từ các nguồn khác nhau (Lopez-Rubio và cộng sự, 2008). Tuy nhiên, tinh thể (được đo bằng nhiễu xạ tia X) và hàm lượng chuỗi xoắn kép (được đo bằng cộng hưởng từ hạt nhân) đều có liên quan chặt chẽ với RS (Lopez-Rubio và cộng sự, 2008). Mặc dù tăng hàm lượng amylose sẽ làm tăng RS3, nhưng việc tạo ra các một lượng quá mức các chuỗi ngắn (DP <10) có thể ức chế sự kết tinh, có khả năng tạo ra một cấu trúc vơ định hình nhiều hơn mà dẫn đến hàm lượng RS thấp (Trinh và cộng sự, 2013). Vì vậy, khi bẻ nhánh, sự lựa chọn của các enzyme là rất quan trọng, trong đó cần chú ý đến việc lựa chọn một pH tối ưu và nhiệt độ để sử dụng nhằm tối đa hóa hiệu suất hoạt động của enzyme. Tuy nhiên, đó là điều rất khó để đánh giá các thông số thời gian và nhiệt độ, cũng như nồng độ của enzyme để sử dụng, do có ảnh hưởng nặng nề và sự biến thiên của amylopectin. Các phản ứng cũng có thể bị ảnh hưởng ở một mức độ nhỏ bởi sự hiện diện của các thành phần khác trong ma trận tinh bột như một lượng nhỏ lipid có thể tạo phức trong việc hình thành RS5, cũng như protein nội sinh và các khoáng chất như phốt pho (Singh và cộng sự, 2003).
34
Phương pháp kết hợp nhiệt ẩm và enzyme
Để thu được nhiều hiệu quả tăng hàm lượng RS trong các loại tinh bột, các nghiên cứu khoa học kết hợp phương pháp nhiệt ẩm và enzyme. Tinh bột hồ hóa hoặc khơng hồ hóa được ủ enzyme sau đó trải qua q trình hấp tiệt trùng, làm lạnh về nhiệt độ phòng, lưu trữ lạnh và cuối cùng là sấy khô.
Phạm Văn Hùng và cộng sự (2012) đã thực hiện phương pháp này trên khoai tây và khoai mỳ và kết quả đạt được với RS tăng cao, cụ thể là 35% RS đối với khoai mỳ và 48% đối với khoai tây. Cùng thời điểm và phương pháp này, ông thực hiện trên đối tượng mới là chuối sứ và chuối già và cũng thu được kết quả tương tự với lượng RS từ 31.8 - 48.1%. Chagam Koteswara Reddy và cộng sự (2013) cũng xử lí nhiệt ẩm và enzyme pullulanse trên tinh bột khoai tây, nhưng lượng RS chỉ đạt được là 29.3%
Tinh bột bắp đã hồ hóa được thủy phân bằng pullulanse trong 12 giờ, tiếp tục trải quá 2 chu kì hấp tiệt trùng – làm nguội. Tinh bột thu được với RS là 23.5%, đặc biệt hơn tinh bột ngơ thồi hóa chỉ cần ủ pullulanse 10 giờ và 2 chu kì hấp tiệt trùng – làm nguội RS có thể đạt tới 32.4%. Hiệu quả bẻ nhánh của pullulanase trên tinh bột ngơ thối hóa giúp hình thành RS hiệu quả nhất, xử lí này được áp dụng để tăng năng suất RS (Xin-Huai Zhao, 2009).
Với hiệu quả làm giàu RS cao như vậy, nhưng việc thực hiện cịn rất ít và hạn hẹp trên một số đối tượng. Ở Việt Nam mới chỉ có một khảo sát làm giàu RS trên chuối sứ, chuối già Phạm Văn Hùng và cộng sự (2012), chưa có nghiên cứu thực hiện trên tinh bột chuối Bom.
*Các chỉ tiêu phân tích, đo lường và đánh giá.
Có rất nhiều phương pháp xử lý trong việc tạo ra RS (Resistant starch preparation). Bảng 1.8 dưới đây mô tả một vài cách thức xử lý khác nhau để tạo RS với những nguồn nguyên liệu khác nhau. Để đánh giá hiệu quả của các phương pháp biến đổi cũng như ghi nhận các tính chất sau biến đổi của tinh bột các chỉ tiêu phân tích quan trọng trong đánh giá cấu trúc và tính chất kèm theo ln là những minh chứng cụ thể cho những nghiên cứu về RS của tinh bột. Dưới đây là một vài nghiên cứu về RS được tập hợp theo nhóm các phương pháp xử lý, trong
35
đó các tác giả đã dùng hàng loạt các chỉ tiêu để xác định cũng như kết luận vấn đề mà họ nghiên cứu. Bảng 1.8. Một số phương pháp tạo RS Nguồn tinh bột Xử lý RS (%) Tác giả Tinh bột gạo -Mẫu chưa xử lý -Nhiệt ẩm (HMT) -Acid and HMT 6.3–10.2 18.5–23.9 30.1–39 Hung và cộng sự. (2015)
Chuối xanh - Tinh bột sống 17.5 Rodriguez và cộng sự. (2008)
Ngô (bắp) Mẫu chưa xử lý 4.6 Chung và cộng sự. (2009)
Nồi Autoclave 24–30 Dundar và cộng sự. (2013)
α-amylase và pullulanase 58.87 Zang và cộng sự. (2011)
Thủy phân bằng acid kết hợp HMT
63.2 Brumovsky và cộng sự. (2001);
Khoai tây Mẫu tinh bột thô 75 Bednar và cộng sự. (2001)
Tinh bột lúa mỳ
Liên kết ngang với sodium trimetaphosphate, sodium tripolyphosphate, epichlorohydrin và phosphoryl chloride 75.6–85.6 Seib và cộng sự. (1999); Zhao và cộng sự (2012) phosphorylation 68.7 Sang và cộng sự. (2010) Tinh bột đậu xanh Acetylation 44 Simsek và cộng sự. (2012 Xác định hàm lượng RS
Một số phương pháp khác hiện đang được sử dụng để đo tinh bột kháng được liệt kê ở Bảng 1.9.
36
Bảng 1.9. Một số phương pháp thông dụng trong đo lường RS Phương pháp Phương pháp đo lường RS Enzyme xử lý Tổng thời gian tiêu hóa Trọng lượng mẫu RS được xác định bởi Tổng lượng chất xơ. AOAC 991.43: (theo Megazyme, 2012). -α-amylase từ vi khuẩn duy trì ổn định trong 30 phút và nhiệt độ 98- 100°C -Protease từ vi khuẩn trong 30 phút ở 60°C -amyloglucosidease từ nấm mốc trong 30 phút ở 60°C 90 phút 1,000± 0,005g Sự khác biệt giữa trọng lượng mẫu được thủy phân và mẫu ban đầu
Megazyme RS /AOAC 2000.02/AACC 32-40 (Theo megazyme 2011)
-Enzyme từ tuyến tụy/ Amyloglucosidease duy trì 16 h ở 37°C 16 giờ 100±5mg Hàm lượng glucose của các phần không thủy phân sót lại; dừng hoạt động thủy phân bằng KOH 2M và hàm lượng glucose xác định bằng quang phổ hấp thu Phương pháp Englyst (Englyst và cộng sự, 1992).
-Enzyme pepsin trong 30 phút ở 37°C
-Enzyme tuyến tụy/ amyloglucosidease/ làm nghịch chuyển đường trong 120 phút ở 37°C 150 phút 700 -900 mg Trọng lượng chất khơ Glucose giải phóng trong 120 phút được trừ từ glucose trong tổng hàm lượng tinh bột của mẫu. Phương pháp Pancreatin– gravimetric (theo Shin và cộng sự, 2004) Pancreatin/promozyme (pullulanase) thủy phân trong 16 h ở 37°C
16 giờ 1,0 g Sự khác biệt giữa trọng lượng thủy phân và các mẫu ban đầu,
37 Phương pháp Goni (theo Goni và cộng sự, 1996). -Pepsin trong 60 phút ở 40°C -Pancreatin trong 16 h ở 37°C 17 giờ 100 mg Hàm lượng glucose của các phần khơng thủy phân cịn lại; hoạt động thủy phân được đình chỉ bởi KOH 2M và xác định glucose bằng quang phổ hấp thu. In vivo Cummings và cộng sự (1976).
-Enzyme nội sinh khác nhau: carbohydrase, lipase, và protease
1,6 – 2,4 lần
Thay đổi Sử dụng bệnh nhân ileostomy: digesta được thu thập khi nó ra khỏi hồi tràng và một số xét nghiệm tinh bột được thực hiện bằng KOH để thủy phân tinh bột còn lại với hàm lượng glucose xác định quang phổ hấp thu Có 3 phương pháp thường dùng để định lượng RS trong nghiên cứu:
- Phương pháp xác định hàm lượng RS theo AOAC 2002.02.
Mẫu thực phẩm hoặc tinh bột để khơ ở nhiệt độ phịng, cân chính xác 100±5mg. Bổ sung 4 ml enzyme gồm α-amylase (30U/ml) và amyloglucosidase (3U/ml), ủ 16h ở nhiệt độ 370C trong tủ lắc (200 vòng/phút). Thêm 4ml ethanol 99% và lắc mạnh, ly tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch, bổ sung thêm 2ml ethanol 50%, trộn mạnh tay sau đó bổ sung tiếp 6ml ethanol 50% và ly tâm 1500 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại 2 lần). Tách bỏ phần dịch, bổ sung 2ml KOH 2M vào phần cặn, lắc mạnh tay trong cốc nước lạnh trong 20 phút, thêm 8ml đệm natriacetate pH=3,8 và 0,1ml enzyme amyloglucosidease (300U/ml), ủ 500C trong 30 phút. Chuyển tồn bộ vào bình định mức 100, định mức 100ml. Tiến hành xác định hàm lượng glucose bằng phương pháp xác định hàm hượng đường khử DNS.
38
Hàm lượng RS được tính theo cơng thức:
% RS = Cx m x 100 x Vđo Vhút x K 106 x 0.9 x 100%
Trong đó: Cx : nồng độ glucose được xác định theo phương trình đường chuẩn m : khối lượng chất khô của mẫu
Vđo : thể tích đem đi đo quang ( 10ml)