a) Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Lấy mẫu Bảo quản
Đồng nhất, pha lỗng mẫu
Nuơi cấy
Chú thích: “*” là chỉ tiêu S. aureus chỉ kiểm đối với mẫu găng tay và yếm
Coliforms Staphylococcus
b) Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu [5]
- Lấy mẫu : Việc lấy mẫu kiểm tra vi sinh vật phải được thực hiện theo trình
tự quy định tại tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 2006-1993. Việc lấy mẫu phải đạt các yêu cầu sau:
+ Mẫu kiểm phải mang tính đại diện cho lơ hàng hoặc nơi lấy mẫu (khi kiểm tra vệ sinh cơng nghiệp) và được nhận dạng rõ ràng, nếu khơng phải lấy nhiều mẫu hơn. Mẫu kiểm của một lơ hàng lớn hoặc mẫu thực phẩm chưa bao gĩi tối thiểu phải đạt 200g, với mẫu bao gĩi tối thiểu chỉ cần 100g.
+ Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác định kể từ khi lấy mẫu đến khi phân tích phải khơng được biến đổi.
+ Đối với mẫu vệ sinh cơng nghiệp được lấy trong diện tích 1dm2 trên bề mặt dụng cụ.
- Chuẩn bị mẫu
Sau khi lấy mẫu ở bề mặt các dụng cụ, phải bảo quản mẫu trong điều kiện vơ trùng, ở nhiệt độ 0 ÷ 40C, và phải chuyển mẫu về phịng thí nghiệm cáng sớm càng tốt và phải phân tích trong vịng 24h kể từ khi lấy.
- Chuẩn bị dụng cụ lấy mẫu : Yêu cầu cần dùng các dụng cụ lấy mẫu như
sau. Kẹp, bình xịt cồn, găng tay, túi PE, tăm bơng, ống chứa nước dịch vơ trùng thùng cách nhiệt bảo quản mẫu,…và dụng cụ phải được hấp, sấy hoặc rửa trong các trong dung dịch tẩy trùng.
- Ghi ký hiệu - nhận dạng mẫu thử
+Phịng thí nghiệm cĩ quy định riêng về ghi ký – mã hiệu cho mẫu để cĩ thể nhận dạng mẫu trong suốt quá trình từ khi lấy mẫu đến khi ghi được kết quả phân tích.
+Ký hiệu, mã hiệu ghi trên mẫu phải đảm bảo bền vững như khơng bị phai mực, rớt.
- Bảo quản mẫu
Mẫu vệ sinh cơng nghiệp:
+ Các mẫu sau khi được lấy vào các ống nghiệm chứa dịch vơ trùng xong đậy nắp lại cho vào thùng cách nhiệt phủ đá vảy xung quanh, nhiệt độ bảo quản là 0 ÷ 40C
+ Sau khi đưa về phịng thí nghiệm nếu chưa phân tích được ngay thì phải bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh và khơng được để quá 24h.
2.2.3. Các mẫu phân tích vi sinh trong đề tài
Mẫu thùng cách nhiệt, rổ nhựa trịn, yếm
Dụng cụ: kẹp, bình xịt cồn, găng tay, ống nghiệm chứa dịch vơ trùng, tăm
bơng vơ trùng, bơng tẩm cồn, bật lửa, bút ghi, thùng cách nhiệt chứa mẫu, túi PE.
Tiến hành
- Dùng cồn khử trùng tay.
- Đặt khuơn lấy mẫu đã khử trùng lên bề mặt dụng cụ diện tích khuơn là 1 dm2. - Thấm ướt tăm bơng bằng dung dịch pha loãng tiệt trùng, dùng tăm bơng quét đều lên diện tích trong khuơn.
- Sau khi quét xong, thao tác gần ngọn lửa đèn cồn, mở nắp ống nghiệm và nhanh chĩng cho tăm bơng vào, vặn chặt nắp ống nghiệm.
- Cho ống nghiệm chứa tăm bơng đã lấy mẫu vào túi PE vơ trùng ghi các thơng tin nhận diện mẫu. Cột chặt miệng túi và chuyển vào thùng vận chuyện mẫu. Bảo quản bằng đá xay nhỏ, phủ quanh mẫu.
Mẫu găng tay
Dụng cụ: kẹp, bình xịt cồn, găng tay, ống nghiệm chứa dịch vơ trùng, tăm bơng vơ trùng, bơng tẩm cồn, bật lửa, bút ghi, thùng cách nhiệt chứa mẫu, túi PE
Tiến hành
- Dùng cồn khử trùng tay.
- Mọi thao tác thực hiện gần đèn cồn, dùng tăm bơng thấm ướt dịch pha lỗng vơ trùng, quét lần lượt trên lịng bàn tay, kẻ ngĩn tay đầu ngĩn tay và cuối cùng là mu bàn tay đeo găng.
- Sau khi quét xong, nhanh chĩng cho tăm bơng vào, đậy nắp ống nghiệm chú ý khơng để ý chạm miệng ống khi cho tăm bơng vào.
- Cho ống nghiệm chứa tăm bơng đã lấy mẫu vào túi PE vơ trùng, ghi thơng tin lấy mẫu vào nhãn, cột kín túi và cho vào thùng vận chuyển mẫu. Bảo quản mẫu bằng đá xay nhỏ phủ quanh túi.
2.2.4. Phương pháp phân tích vi sinh vật tại phịng thí nghiệm Cơng ty cổ phần Nha Trang Seafoods – F.17 Nha Trang Seafoods – F.17
2.2.4.1. Xác định Coliforms tổng số theo phương pháp đổ đĩa (CFU/dm2) [13]
[Colifom được xác định theo NMKL No 44, 6thEd. 2004]. 1. Mục đích áp dụng
Phương pháp này được(tham chiếu theo NMKL số 44 tái bản lần thứ 6 năm 2004) áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm để xác định Coliforms tổng số.
2. Định nghĩa
Trong phương pháp này Coliforms được hiểu là những vi khuẩn cho khuẩn
lạc điển hình trên mơi trường thạch Violet Red Bile (VRB) ở 370C trong 24 giờ. Trong trường hợp nghi ngờ, vi khuẩn sẽ được khẳng định trong mơi trường canh Brilliant Green Bile Salt Lactose, Coliforms sẽ sinh khí trong mơi trường này trong 24 giờ ở 370C.
3. Nguyên tắc
Cấy lượng mẫu đã xác định lên mơi trường rắn chọn lọc (thạch Violet Red Bile). Ủ ở 37 0C trong 48 giờ. Đếm các khuẩn lạc điển hình và khẳng định bằng test phù hợp.
4. Dung dịch pha loãng và mơi trường nuơi cấy - Dung dịch pha lỗng: nước cất vơ trùng.
- Mơi trường cấy: thạch Violet Red Bile (VRB) và canh Brilliant Green Bile Lactose (BGBL).
Thự hiện pha mơi trường theo hướng dẫn HB – LAB 5.4/04 - Sổ tay pha chế hĩa chất phịng thí nghiệm. 5. Thiết bị - Máy vortex. - Nồi hấp tiệt trùng. - Tủ ấm 37.0± 1.00C. - Ống Durham.
6. Quy trình 6.1 Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu và pha lỗng (tham chiếu theo NMKL91). 6.2 Đổ đĩa
Cấy lần lượt 1 ml nồng độ ban đầu và 1 ml cĩ nồng độ 10-1 vào 2 đĩa Petri. Thêm 10 -15 ml mơi trường thạch VRB đã được làm nguội ở 450C. Trộn đều mẫu bằng cách xoay trịn đĩa theo chiều và ngược chiều kim dồng hồ. Sau khi mơi trường đơng, thêm một lớp mỏng mơi trường thạch VRB lên đĩa.
6.3 Nuơi ủ
Các đĩa được lật ngược và ủ ở 37.0 ±1.00C trong 48h.
6.4 Đọc kết quả: đếm các đĩa cĩ số khuẩn lạc dưới 100. Khuẩn lạc Coliforms điển hình cĩ màu đỏ sậm, đường kính lớn hơn hoặc bằng 0.5 mm và được bao quanh vùng kết tủa màu đỏ.
6.5 Khẳng định
Cấy ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ của mỗi loại đặc trưng và khơng đặc trưng trong mơi trường canh Brilliant Green Bile Lactose, ủ ở 37.0± 1.00C trong 24±3 giờ và ống mơi trường nào xuất hiện khí thì xem như phản ứng dương tính (tồn bộ phần uốn cong của ống Durham đầy khí)
6.6 Báo kết quả
Chọn các đĩa cĩ số khuẩn lạc ít hơn 100 để đếm. Kết quả đếm Coliforms
trong 1dm2 bằng cách nhân số khuẩn lạc đã đếm với nồng độ pha lỗng và tỉ lệ xác định.
Trong trường hợp khơng cĩ khuẩn lạc điển hình hay tỉ số khẳng định bằng 0, thì kết quả được báo cáo là 0.
2.2.4.2. Phương pháp định lượng Staphylococcus aureus [12] (NMKL 66. 4th - 2008) (NMKL 66. 4th - 2008)
1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này (tham chiếu theo NMKL 66. 4th - 2008) dùng để định lượng
2. Định nghĩa
Staphylococcus aureus là những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, gram
dương, hình cầu và cho catalase, coagulase, BP và BA dương tính. 3. Nguyên tắc
Staphylococcus cĩ những lồi làm đơng huyết tương (coagulase dương tính)
và cũng cĩ những lồi khơng làm đơng huyết tương (coagulase âm tính). Và tất cả chúng đều cĩ khả năng sinh độc tố. Nhưng do đồng nhất tính chất đơng huyết tương với khả năng sinh độc tố gây bệnh nên thường người chỉ tập trung phân tích các loài
Staphylococci coagulase dương tính.
Định lượng Staphylococcus aureus được thực hiện bằng cách cấy trang một lượng mẫu đã biết lên mơi trường thạch Baird Parker (BP), vi khuẩn cho những khuẩn lạc đặc trưng (nếu cĩ), và được xác định lại bằng phản ứng coagulase.
4. Mơi trường:
Dung dịch Salin Pepton: SPW
Thạch Baird parker : BPA
Huyết tương thỏ
Thực hiện pha chế mơi trường theo HD-LAB 5.4/04 – sổ tay hướng dẫn pha chế hĩa chất mơi trường PTN.
5. Thiết bị chính - Máy vortex. - Nồi hấp tiệt trùng. - Tủ ấm 37.0± 1.00C. - Bể điều nhiệt 450C.
Vận hành thiết bị theo HD-LAB 5.5/01 – sổ tay hướng dẫn vận hành thiết bị. 6. Quy trình
6.1 Chuẩn bị mẫu
Cho ống nghiệm chứa mẫu vào máy vortex để trộn đều mẫu khoảng 30s và tách hết vi khuẩn trên tăm bơng vào dung dịch vơ trùng. Chọn nồng độ thích hợp để tránh sự sinh trưởng quá mức. Nếu khuẩn lạc mọc quá dày thì chúng sẽ nhỏ và
khơng thể hiện được tính đặc trưng và do đĩ khĩ nhận dạng, đếm. Những đĩa thích hợp cho việc nhận dạng và đếm là cĩ số khuẩn lạc từ 20 – 200.
6.2 Cấy mẫu
Mỗi độ pha lỗng cấy trang 1 ml dịch mẫu sang 02 đĩa bằng que cấy hình tam giác đã được thanh trùng sang mơi trường thạch BP. Chờ khoảng 15 phút cho mẫu được thẩm thấu khơ trước khi đem ủ. Kết quả ở 2 đĩa này được xử lý như 1 đĩa trong quá trình đọc, khẳng định và báo cáo kết quả.
6.3 Nuơi ủ
Lật ngược các đĩa và ủ ở 37 0C±1.0 trong 24h ±3 và tiếp tục ủ thêm tổng cộng 48h ± 4.
6.4 Đọc kết quả
Sau nuơi ủ, trên mơi trường thạch Baird Parker khuẩn lạc coagulase positive
staphylococci cĩ đường kính 1 – 2,5 mm, trịn, màu đen (hoặc xám) sáng, lồi. Mỗi
khuẩn lạc cĩ vịng sáng bao quanh cĩ đường kính 2 – 4mm. Một vài chủng khơng cĩ vịng sang bao quanh (khơng điển hình) cả hai loại khuẩn lạc này đều được đánh dấu trên đĩa petri. Khi chích que cấy vào khuẩn lạc, nhận thấy khuẩn lạc cĩ tính sáp, dính và chắc.
6.5 Khẳng định
Ghi lại số khuẩn lạc điển hình và khơng điển hình ở mỗi đĩa. Đối với nồng độ pha lỗng thấp nhất cĩ < 20 khuẩn lạc, tính luơn số khuẩn lạc này. Nếu đĩa cĩ > 200 khuẩn lạc điển hình và những khuẩn lạc này nhưng khơng xuất hiện ở nồng độ pha lỗng cao hơn, tính số khuẩn lạc này nhưng khơng tính số khuẩn lạc khơng điển hình.
6.5.1 Cấy chuyền thơng thường 5 khuẩn lạc điển hình và khơng điển hình sang mơi trường huyết tương thỏ đã hồn nguyên, ủ ở 370C ± 1, xem xét mức độ đơng huyết sau mỗi 6h, xem xét lại sau 24h ủ.
- Dương tính: nếu khối đơng hình thành (hồn tồn hay hơn 1/2 ).
- Âm tính: khơng hình thành khối đơng, dịch huyền phù vẫn giữ nguyên (như lúc mới cấy xong)
6.5.2 Cấy chuyền đồng thời những khuẩn lạc trên (điển hình và khơng điển hình) sang mơi trường BA, ủ ở 370C± 1 trong 24h ± 2
Trên BA, khuẩn lạc màu xám trắng hoặc vàng nhạt, đường kính 1,0 – 2,0 mm dạng lồi, bĩng, đục. Các chủng Staphylococcus đều tạo vịng tan huyết nhưng đơi khi cũng cĩ chủng khơng tan huyết.
Khuẩn lạc làm tan huyết, điển hình và khơng điển hình. Trên BA được sử dụng để thử nghiệm Gr và catalase. Staphylococcus cho phản ứng Gr+ và catalase(+)
6.6 Đọc kết quả
Cộng tất cả số khuẩn lạc cho phản ứng dương tính ở 3 đĩa, nhân với hệ số pha lỗng để báo cáo số Staphylococcus/g sản phẩm (dm2).
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê tốn học dựa trên phầm mềm tốn học MS-EXCEL.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu sự biến đổi số lượng Coliforms trước và sau khi vệ sinh khử trùng thùng cách nhiệt đựng tơm nguyên liệu, bán thành phẩm bằng 3 nồng độ chlorine 20; 50; 100ppm với 2 chế độ vệ sinh sạch và khơng sạch trước đĩ
Bảng 3.1: Kết quả số lượng Coliforms trên các thùng cách nhiệt đựng tơm sau khi vệ sinh và khử trùng bằng 3 nồng độ chlorine 20; 50; 100ppm với 2 chế độ vệ sinh sạch và khơng sạch Tên mẫu Lần TN Kết quả Coliforms (CFU/dm2) Ghi chú 1 80
Thùng vệ sinh sạch trước dội chlorine 2 55
100ppm 3 70
1 0
Thùng vệ sinh sạch sau dội chlorine 2 0
100ppm 3 0
1 256
Thùng vệ sinh khơng sạch trước dội 2 210
chlorine 100ppm 3 180 Thùng đựng
1 143 nguyên liệu
Thùng vệ sinh khơng sạch sau dội chlorine 2 112
100ppm 3 90
1 49
Thùng vệ sinh sạch trước khi dội chlorine 2 53
50ppm 3 40
1 0
Thùng vệ sinh sạch sau dội chlorine 2 0
1 200 Thùng vệ sinh khơng sạch trước khi dội 2 194
chlorine 50ppm 3 158
1 135
Thùng vệ sinh khơng sạch sau khi dội 2 127
chlorine 50ppm 3 108
Thùng vệ sinh sạch trước khi dội chlorine 1 60
20ppm 2 87
3 108
1 6
Thùng vệ sinh sạch sau dội chlorine 2 24
20ppm 3 36
1 190
Thùng vệ sinh khơng sạch trước khi dội chlorine 2 147
20ppm 3 240
1 148
Thùng vệ sinh khơng sạch sau khi dội chlorine 2 110
20ppm 3 195
1 50
Thùng vệ sinh sạch trước dội chlorine 2 67 Thùng đựng
100ppm 3 47 bán thành
1 0 phẩm
Thùng vệ sinh sạch sau dội chlorine 2 0
100ppm 3 0
1 245
Thùng vệ sinh khơng sạch trước dội 2 220
chlorine 100ppm 3 172
1 130
Thùng vệ sinh khơng sạch sau dội chlorine 2 120
100ppm 3 80
Thùng vệ sinh sạch trước khi dội chlorine 1 57
3 67
1 0
Thùng vệ sinh sạch sau dội chlorine 0 0
50ppm 3 0
1 240
Thùng vệ sinh khơng sạch trước khi dội 2 232
chlorine 50ppm 3 175
1 145
Thùng vệ sinh khơng sạch sau khi dội 2 138
chlorine 50ppm 3 103
1 38
Thùng vệ sinh sạch trước khi dội chlorine 2 40
20ppm 3 33
1 4
Thùng vệ sinh sạch sau dội chlorine 2 5
20ppm 3 0
1 200
Thùng vệ sinh khơng sạch trước khi dội 2 160
chlorine 20ppm 3 230
1 150
Thùng vệ sinh khơng sạch sau khi dội 2 120
0 20 40 60 80 100 120 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 Thùng vệ sinh sạch dội chlorine 100ppm Thùng vệ sinh sạch dội chlorine 50ppm Thùng vệ sinh sạch dội chlorine 20ppm Mẫu S ố k h u ẩn l ạc ( cf u /d m ) Kết quả Coliforms Trước dội chlorine Kết quả Coliforms Sau dội chlorine
Hình 3.1: Biểu đồ so sánh số lượng Coliforms trên các mẫu thùng cách nhiệt tơm NL vệ sinh sạch trước và sau khi khử trùng bằng chlorine với 3 nồng độ lần lượt là 100ppm; 50ppm và 20ppm.
Ghi chú: số liệu vẽ đồ thị hình 3.1 thể hiện tại phụ 1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 Thùng sau vệ sinh sạch dội chlorine 100ppm Thùng sau vệ sinh sạch dội chlorine 50ppm Thùng sau vệ sinh sạch dội chlorine 20ppm Mẫu S ố k h u ẩn l ạc ( cf u /d m 2 ) Kết quả Coliforms Trước dội chlorine Kết quả Coliforms Sau dội chlorine
Hình 3.2: Biểu đồ so sánh số lượng Coliforms trên các mẫu thùng cách nhiệt
đựng tơm BTP vệ sinh sạch trước và sau khi khử trùng bằng chlorine với 3 nồng độ lần lượt là 100ppm; 50ppm và 20ppm
Nhận xét: qua kết quả nghiên cứu thể hiện trên 2 đồ thị 3.1 và 3.2 cho thấy số lượng Coliforms trên các thùng cách nhiệt đựng NL và BTP sau vệ sinh trước khi
dội chlorine chỉ cĩ một mẫu ở thùng đựng NL là vượt quá tiêu chuẩn cho phép 100CFU/dm2 là 108CFU/dm2, cịn lại đều nằm trong tiêu chuẩn cho phép. Sau khi dội chlorine thì số lượng Coliforms giảm đi rõ rệt thậm chí là 0CFU/dm2, riêng 3 mẫu dội chlorine 20ppm là vẫn cịn hiện diện của Coliforms nhưng rất ít. Chứng tỏ việc vệ sinh sạch trước đĩ bản thân đã làm giảm số lượng vi sinh vật đến gần hoặc nằm dưới ngưỡng cho phép và giúp chlorine phát huy tác dụng tối đa. Với chlorine 100ppm và 50ppm cho hiệu quả khử trùng tốt hơn chlorine 20ppm.
0 50 100 150 200 250 300 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 Thùng sau vệ sinh khơng sạch dội chlorine 100ppm Thùng sau vệ sinh khơng sạch dội