Mục đích của bước này là để kiểm tra xem DNA plasmid vừa tách chiết có mang đoạn gen pagA hay không. Sau phản ứng cắt, kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Nếu kích thước bằng với kích thước đoạn gen gắn vào vectơ chứng tỏ việc tạo dòng thành công. Ngoài ra, còn được sử dụng để xử lý đoạn gen pagA và vectơ biểu hiện tạo đầu dính, thuận lợi cho việc gắn gen vào vectơ biểu hiện.
Enzym giới hạn là những endonucleotid có khả năng thủy phân DNA mạch kép ở các vị trí có trình tự xác định.
Có 2 kiểu là cắt đầu bằng và cắt đầu so le. Ở đây sử dụng 2 enzym cắt đầu so le là BamHI và XhoI.
Vị trí cắt của XhoI:
Thành phần của phản ứng cắt như sau:
BamHI (Fermentas) 0,4 l
XhoI (Bio Lab) 0,4 l
DNA plasmid 3 l
Buffer 2 (Bio Lab) 1 l
H2O 5,2 l Thành phần phản ứng cắt lượng lớn:
Thành phần phả ứng cắt vector biểu hiện pET - TRX - FUS:
BamHI (Fermentas) 3 l
XhoI (Bio Lab) 3 l
pET - TRX - FUS 20 l
Buffer 2 (Bio lab) 3 l
Thành phần phả ứng cắt vector tái tổ hợp pCR2.1 - pagA:
BamHI (Fermentas) 2 l
XhoI (Bio Lab) 2 l
pCR2.1 - pagA 15 l
Buffer 2 (Bio lab) 2 l
2.3.6. Phƣơng pháp lai [30]
Sau khi thu được sản phẩm PCR của gen pagA, tiến hành gắn sản phẩm PCR vào vector pET - TRX - FUS với thành phần phản ứng như sau:
Tỷ lệ Insert : Vector = 3 : 1
Buffer T4 1 l
pCR2.1 - pagA 4 l
Vector pET - TRX - FUS 4 l
Để ở 140C qua đêm.
2.3.7. Phƣơng pháp tạo tế bào khả biến E. coli
Chủng E. coli DH5 được nuôi qua đêm trên môi trường LB có bổ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sung kháng sinh kanamycin ở máy lắc 370
C, 200 v/p.
Cấy chuyển 10% và tiếp tục nuôi lắc 1,5h ở 370C, 200v/p, để OD = 0,4 – 0,6.
Để 40
C trong 1h.
Ly tâm 6000 v/p (10 phút), thu tế bào và rửa bằng nước khử ion, ly tâm 6000 v/p (10 phút) thu tế bào.
Bổ sung 1ml CaCl2 0,1M, vortex, để trên đá trong 2h.
Ly tâm 6000 v/p (10 phút), thu cặn.
Bổ sung 1ml CaCl2 0,1M, vortex, để trên đá trong 1h.
Ly tâm 6000 v/p (10 phút), thu cặn.
Bổ sung 60 l CaCl2 0,1M + 30 l Glyxerol 60%.
Bảo quản ở -700
C.
2.3.8. Phƣơng pháp biến nạp vào tế bào khả biến [30]
Quá trình biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt. Các bước thực hiện như sau:
Làm tan tế bào khả biến trong đá 30 phút.
Bổ sung sản phẩm lai và để trong đá 30 phút.
Sốc nhiệt 420C trong 60 giây, chuyển nhanh sang đá.
Bổ sung 200 l môi trường LB và lắc 370C, ở 200 v/p trong 1h.
Sau đó, đem cấy trải đều 100 l trên đĩa Petri vó bổ sung kanamycin (25 mg/ml) ở nồng độ cuối là 50 g/ ml.
2.3.9. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % [30]
Điện di trên gel polyacrylamide thường được sử dụng để tách riêng các băng protein có trọng lượng phân tử khác nhau, đôi khi phương pháp này còn được dùng để tách các đoạn DNA có kích thước nhỏ (dưới 200 bp). Trong phương pháp này, gel được đổ giữa hai bản thủy tinh mỏng theo phương thẳng đứng. Công thức đổ gel polyacrylamide 12,6 %:
Gel tách: dH2O 1,968 ml Tris HCl (3M; pH 8,8) 1 ml Acrylamide – bis 30% 3,36 ml Glycerol 50 % 1,6 ml SDS 10 % 40 l APS 10 % 40 l Temed 6,4 l Gel cô: dH2O 0,85 ml Tris HCl (3M; pH 8,8) 165,25 l Acrylamide – bis 30% 212,5 l SDS 10 % 6,25 l APS 10 % 12,5 l Temed 1 l
Mẫu sau khi được xử lý với SDS buffer và biến tính (95 oC trong 10 phút) được tra vào các giếng nhỏ trong gel.
Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 300 V hoặc cường độ dòng điện là 40 mA.
Sau khi điện di xong, bản gel được gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Coomassie Brilliant Blue 0,25 %, lắc khoảng 1 giờ trên máy lắc. Sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dung dịch tẩy màu, lắc trên máy lắc khoảng 30 phút thì đổ dịch nhuộm đi cho nước vào và có thể quan sát trực tiếp.
2.3.10. Phƣơng pháp biểu hiện gen
Cấy hoạt hoá 1 khuẩn lạc trong môi trường LB có bổ sung kanamycin (25 mg/ ml) với nồng độ cuối là 50 g/ ml, nuôi lắc ở 370C qua đêm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấy chuyển 1% vào 20 ml môi trường MPB có bổ sung kháng sinh
kanamycin nồng độ là 50 g/ ml và nuôi lắc ở 370C để OD đạt 0,5-0,8 (Khoảng 2-3h).
Hút 10 ml làm đối chứng trước cảm ứng và tiếp tục nuôi lắc ở 370
C trong 4h để thu mẫu không cảm ứng.
Phần còn lại, cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi ở 370
C trong 4h.
Thu mẫu sau cảm ứng, ly tâm thu tế bào 6000 v/p trong 10 phút.
Rửa tế bào bằng nước khử ion 200 l, ly tâm 6000 v/p trong 5 phút, thu tế bào.
Bổ sung 200 l nước khử ion, làm tan tế bào.
Lấy 30 l dịch trên bổ sung thêm 5 l treatment buffer 6X.
Xử lý mẫu ở 950
C trong 10 phút.
Điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.
Nhuộm bản gel bằng Comassie Brilliant trong 30 phút trên máy lắc.
Tẩy màu và quan sát trực tiếp.
2.3.11. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện a, Khảo sát điều kiện nhiệt độ thời gian và thích hợp cho quá trình biểu hiện a, Khảo sát điều kiện nhiệt độ thời gian và thích hợp cho quá trình biểu hiện
Quá trình biểu hiện được thực hiện ở các nhiêt độ khác nhau (250C, 280C, 300C, 370C) với nồng độ cảm ứng IPTG (100mM) 1mM ở 370
C trong 5h và lấy mẫu theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, 5h) để xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen pagA
b, Khảo sát nồng độ IPTG thích hợp cho quá trình biểu hiện
Cố định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen pagA, tiến hành biểu hiện lại ở những nồng độ IPTG khác nhau, cụ thể là: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1; 2 mM.
Thu mẫu và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid 12,6%.
2.3.12. Xác định khả năng hoà tan của protein
- Mẫu sau khi biểu hiện được ly tâm 6000 v/p trong 10 phút, thu tủa. - Rủa tế bào và ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút.
- Bổ sung 100 ml dung dịch C. - Ủ ở 370
C trong 30 – 60 phút.
- Siêu âm.
- Ly tâm, thu dịch pha trên (phần tan).
- Phần cặn bổ sung 1 l nước khử ion, vortex.
- l Treatment buffer 6X (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Điện di kiểm tra khả năng hòa tan của protein trên gel polyacrylamide 12,6%.
2.3.13. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin
Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng inclusion bodies. Sử dụng phương pháp tinh sạch bằng Kit ProBond TM
của hãng invitrogen có thể chuyển protein từ dạng không hoà tan thành dạng hoà tan, điều này hết sức quan trọng cho mục đích tạo ra các protein tái tổ hợp để phát triển các Kit chuẩn đoán. Quá trình tinh sạch được thực hiện theo các bước sau:
Bƣớc 1: Chuẩn bị dịch tế bào trƣớc khi đƣa lên cột - Làm tan hoàn toàn Guanidinium Lysis Buffer
- Ly tâm huyền dịch tế bào (100 ml) đã kiểm tra khả năng biểu hiện, thu cặn tế bào.
- Hoà lại tế bào trong 8 ml Guanidinium Lysis Buffer, pH= 7,8.
- Làm tan cặn tế bào bằng cách lắc nhẹ trên máy vortex ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 phút.
- Phá màng tế bào bằng máy siêu âm trong thời gian 15 phút – 20 phút, để huyền dịch tế bào trên đá, phá tế bào bằng máy Labsonic
- Ly tâm dịch phá tế bào ở tốc độ 1000 vòng trong thời gian 15 phút, thu dịch nổi, loại xác tế bào.
Bƣớc 2: Chuẩn bị cột
- Lắc đều để proBond TM Resin tạo thành huyền dịch đồng nhất
- Dùng pipet hút 2ml huyền dịch Nikel Resin đưa lên cột tinh sạch dung tích 10ml
- Rửa cột bằng 6 ml nước khủ ion
- Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer
- Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phương thẳng đứng để Resin lắng xuống. Bổ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer
- Hoà lại Resin bằng cách đảo cột bằng tay, sau đó để cột lại theo phương thẳng đứng để Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột và cho dịch chảy qua cột
Bƣớc 3 : Đƣa protein lên cột và đẩy ra khỏi cột - Đưa 8 ml dung tích phá tế bào sau ly tâm lên cột
- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút - 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó để cột lại theo phuong thẳng đứng để huyền dịch Nikel Resin lắng xuống và cho dịch chảy qua cột.
- Rửa cột bằng 4ml Denaturing Binding Buffer, pH= 7,8, lặp lại 3 lần. - Rửa cột bằng 4ml Denaturing Wash Buffer, lặp lại 3 lần
- Rửa cột bằng 8 ml Native Wash Buffer
- Đẩy protein tái tổ hợp ra khổi cột bằng 8 ml Native Elusion Buffer, thu 12 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml
- Kiểm tra protein sau tinh sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.
2.3.14. Phƣơng pháp Western Blot [3, 25]
Đây là phương pháp lai protein với kháng thể đặc hiệu, sử dụng trong các nghiên cứu protein và enzyme.
Các bước thực hiện phản ứng Western blot như sau:
– Bước 1: Protein PA được điện di trên gel 12,6 % polyacrylamide, – Bước 2: Ngâm màng PVDF trong methanol lạnh (–20 o
C) trong 5 phút rồi rửa bằng dung dịch blotting buffer, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
– Bước 3: Chuyển protein sang màng PVDF trong blotting buffer (điện trường 100 V, 2 giờ trên máy khuấy từ, trong tủ lạnh),
– Bước 4: Thu màng PVDF và nhuộm đánh dấu bằng Ponceau trong 5 phút để đánh dấu băng protein,
– Bước 5: Rửa màng 3 lần bằng dH2O,
– Bước 6: Phủ màng bằng skim milk 5 % trong TTBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng, 2 giờ,
– Bước 7: Rửa màng 3 lần bằng TTBS 1X, 5 – 10 phút/lần, Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, 5 – 10 phút/lần,
– Bước 8: Nhuộm kháng thể 1 (kháng thể kháng protein PA tái tổ hợp) đã pha loãng 500 lần trong skim milk 1 % trong TTBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng, 2 giờ,
– Bước 9: Rửa màng 3 lần bằng TTBS 1X, 5 – 10 phút/lần, Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, 5 – 10 phút/lần,
– Bước 10: Nhuộm kháng thể dê kháng kháng thể thỏ cộng hợp HRP đã pha loãng 10.000 lần trong skim milk 1 % trong TTBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng, 2 giờ,
– Bước 11: Rửa màng 3 lần bằng TTBS 1X, 5 – 10 phút/lần, Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, 5 – 10 phút/lần,
– Bước 12: Bổ sung chất hiện màu (5 ml methanol + 15 mg HRP colour hòa trong 25 ml TBS + 25µl H2O2), để phản ứng xảy ra trong tối.
Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel 0,8% agarose
Giếng 1: DNA tổng số
1 2 CHƢƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA tổng số
Chủng vi khuẩn B. anthracis
VCM1167 được nuôi qua đêm trên môi trường LB, sau đó ly tâm để thu tế bào và tiến hành tách chiết DNA tổng số. Kết quả điện di trên gel 0,8 % agarose thể hiện ở hình 3.1:
Kết quả chỉ cho một băng duy nhất thể hiện ở hình 3.1 cho thấy
quy trình tách DNA tổng số và các hoá chất dùng cho việc tách chiết, tinh sạch DNA là phù hợp.
3.2. Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR
Sau khi tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. anthracis, tiến hành khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR. Phản ứng này được thực hiện sử dụng cặp mồi BA1 và BA2, có sự tham gia của enzyme Taq polymerase và dNTPs. Sản phẩm PCR của gen pagA được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8% agarose , thể hiện ở hình 3.2:
Kết quả ở hình trên chỉ cho một băng duy nhất có kích thước ~ 2,2 kb như tính toán lý thuyết. Như vậy, cặp mồi BA1 và BA2 được thiết kế với độ đặc hiệu cao, chu trình nhiệt là phù hợp.
Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR của gen pagA trên gel 0,8% agarose
Giếng 1: Thang DNA chuẩn (Fermentas) Giếng 2: Sản phẩm PCR 1 2 2,2 kb 3 2 kb
3.3. Tách dòng gen pagA
3.3.1. Biến nạp vector mang gen pagA vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α DH5α
Để khẳng định kết quả của kĩ thuật PCR, chúng tôi tiến hành tách dòng gen pagA mã hoá kháng nguyên bảo vệ PA. Sản phẩm PCR được gắn vào vector pCR2.1 nhờ enzyme nối T4 ligase. Sau đó, sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α nhờ sốc nhiệt và nuôi trong môi trường SOC ở 37o
C. Tiến hành cấy trải dịch nuôi trên môi trường LBA có chứa nhân tố chọn lọc X-gal và ampicillin. Sau khi ủ qua đêm ở 37oC, trên đĩa petri xuất hiện hai dòng khuẩn lạc xanh và trắng, thể hiện ở hình 3.3:
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo lý thuyết, những dòng khuẩn lạc trắng có khả năng mang đoạn gen
pagA mong muốn. Tuy nhiên, cần phải tiếp tục nghiên cứu các dòng khuẩn lạc trắng để đưa ra kết luận chính xác.
3.3.2. Kiểm tra sự tồn tại của gen pagA trong vector tái tổ hợp
Các khuẩn lạc trắng riêng rẽ được nuôi cấy trong môi trường LB có chứa ampicillin, lắc 200 v/p để qua đêm ở 37oC. Sau đó tiến hành tách chiết plasmid và kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose. Kết quả thể hiện ở hình 3.4:
Hình 3.3. Khuẩn lạc E. coli DH5α trên môi trường LBA chứa X - gal và ampicillin
Theo lý thuyết điện di, DNA kích thước lớn hơn sẽ chạy chậm hơn nghĩa là ảnh quan sát được là vạch sáng cao hơn và ngược lại. Do đó, có thể dự đoán DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 1 và 9 đã mang gen pagA. Tuy nhiên để kết luận chính xác về hai dòng này cần thực hiện phản ứng cắt bằng en zym giới hạn và phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen pagA với khuôn là 1 dòng plasmid 1 và 9.
a. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
Trước tiên, DNA plasmid được xử lý bằng enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra sự có mặt của gen pagA. Kết quả thể hiện ở hình 3.5 cho thấy các plasmid từ các dòng khuẩn lạc 1, 9 (giếng 2,3) sau khi cắt bằng enzyme
EcoRI cho hai băng tương ứng với sản phẩm PCR đã được cắt bằng EcoRI (giếng 1). Điều này chứng tỏ đoạn gen pagA 2,2 kb của vi khuẩn này có chứa điểm cắt của EcoRI. Theo trình tự gen pagA đã công bố, chúng tôi nhận thấy vị trí cắt của EcoRI chia đoạn pagA thành hai đoạn có kích thước khoảng 1 kb và 1,2 kb. Như vậy các dòng 1, 9 là các dòng có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen pagA có kích thước 2,2 kb của vi khuẩn B. anthracis. Còn dòng khuẩn lạc xanh (giếng 4) chỉ có vector 3,9 kb mà không mang đoạn gen này.
Hình 3.4. Điện di DNA plasmid từ các dòng khuẩn lạc xanh và trắng trên gel 0,8 % agarose
Do trên 2 mồi BA1 và BA2 có chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn
BamHI và XhoI nên đề tài tiến hành cắt kiểm tra để đảm bảo rằng quá trình tách dòng không làm ảnh hưởng đến vị trí cắt của enzyme giới hạn nhằm phục vụ cho việc lắp ghép đoạn gen pagA vào vector biểu hiện sau này. Sản phẩm cắt được điện di trên gel 0,8 % agarose (Hình 3.6). Kết quả cho thấy plasmid dòng số 1, 9 sau khi cắt bằng 2 enzyme tạo ra 2 băng, băng lớn là vector tách dòng có kích thước 3,9 kb, băng nhỏ có kích thước khoảng 2,2 kb tương ứng với sản phẩm PCR của gen pagA. Điều này chứng tỏ 2 plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen pagA 2,2 kb và quá trình tách dòng không ảnh hưởng đến 2 vị trí cắt của enzyme giới hạn trên 2 mồi.