2.2.1. Hoá chất, dung dịch
Các hoá chất dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử được mua từ các hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio- Rad, bao gồm: dNTP, Taq polymerase, agarose 1%, polyacrylamide, marker, ethidium bromide, protease, RNAse, axid acetic, kháng sinh Kanamycin, IPTG, enzym, Chloroform…
Các hoá chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật bao gồm: cao nấm men, cao thịt, trypton, agar, glucose, NaCl…
Các dung dịch:
Dung dịch (Sol) I: Tris – HCl 1M; pH8 2,0 ml EDTA 0,5M; pH8 1,6 ml Glucose 0,72g H2O
khử ion tới 80 ml
Dung dịch (Sol) II: NaOH 3M 100 l SDS 10% 150 l H2O khử ion 1250 l
Dung dịch (Sol) III: CH3COOK 3M 23,52 g CH3COOH 9,2ml
Dung dịch TAE 50X: Tris base 121 g EDTA 0,5M; PH8 50 l CH3COOH 28,6 l H2O khử ion tới 50 ml
Dung dịch TAE 1X: Dung dịch TAE 50X: 10ml Nước cất: 490ml
Gel agarose 1% Agarose 1% 1,0g Bổ sung TAE đến 100ml
Loading Dye Bromophenol Blue 1% 1,0 ml Glycerol 87% 3,45 ml H20 khử ion 5,55 ml CH3COONa(3M; pH 5,2) CH3COONa 24,61 g H2O khử ion vừa đủ đến 100 ml Chỉnh pH bằng CH3COOH RNAse 10 mg/ ml Tris (0,1M; pH 7,5) 0,15 ml NaOH 1M 0,022 ml H2O khử ion 1,328 ml Marker Dye 6X 6 l Marker 20 l H2O khử ion 90 l dNTP 10mM dNTPs mix 10 l H2O khử ion 90 l Kanamycin 25 mg/ ml Kanamycin 25 mg H2O khử ion 1 ml SDS 10% SDS 3 g H2O khử ion 30 ml
Glycerol 50% Glycerol pure 20 ml H2O khử ion 20 ml
Lyzozym 10 mg/ ml Lyzozym 10 mg H2O khử ion 1 ml IPTG 100mM IPTG 0,031 g H2O khử ion 1,3 ml EDTA (0,5 M; pH 8) EDTA 14,61 g H2O khử ion 100 ml Chỉnh pH bằng NaOH Dung dịch đệm SDS – PAGE 10X Tris base 15,14 g Glycine 72,1 g SDS 20% 25 ml H2O khử ion 500 ml Dung dịch đệm SDS – PAGE 1X SDS – PAGE 10X 100 ml H2O khử ion 900 ml
Dung dịch tẩy màu Methanol 500 ml Acid acetic 100 ml H2O khử ion 400 ml
Dung dịch nhuộm Coomasive Brilliant Blue 0,25%
Coomasive Brilliant Blue 0,25 g Dung dịch tẩy màu 100 ml
Dung dịch Acrylamide – bisacrylamide 30%
Acrylamide 29 g Bisacrylamide 1 g H2O khử ion 100 ml
Guanidinium Lysis Buffer
Gu.HCl 6M NaH2PO4 200mM NaHPO4 200mM NaCl 500mM Nước pH= 7,8
Denaturing Binding Buffer
Ure 8M NaCl 500mM NaHPO4 20mM NaH2PO4 20mM pH= 7,8
Denaturing Wash Buffer Ure 8M NaHPO4 20mM NaH2PO4 20mM NaCl 500mM pH= 6,0 Imidazole 3M, pH= 6 Imidazole 3M NaCl 500mM NaHPO4 20mM NaH2PO4 20mM pH 6,0
Native Purification Buffer 5X
NaH2PO4 2 50 mM NaCl 2,5 M pH 8,0
Native Purification Buffer 1X
Native Purification Buffer 5X 100 ml Nước khử ion 400 ml
Wash Buffer Native Purification Buffer 1X 50 ml Imidazole 3M, pH= 6,0 335 l
pH 8,0
Native Elusion Buffer
Native Purification Buffer 1X 41,25 ml Imidazole 3 M, pH= 6,0 3,75 ml pH 8,0 Solution A Tris HCl (0,5M; pH7) 5 ml EDTA (0,5M; pH8) 4 ml Nước khử ion 91 ml Solution B1 Lysozym 100 mg/ ml Solution B2 Triton X - 100 1% Solution C Solution A 970 l Solution B1 10 l Solution B2 20 l
2.2.2. Môi trƣờng
L B Cao nấm men 3g Trypton water (Trypton; NaCl) 15g Nước cất tới 1l pH 7
LBA Cao nấm men 3g Trypton water (Trypton; NaCl) 15g Agar 20g Nước cất tới 1l
pH 7
Thiêu phần thiết bị
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Từ nguồn nguyên liệu là plasmid chứa đoạn gen pagA đã được tách dòng và đọc trình tự [3] và plasmid chứa vector pET – TRX – FUS, quy trình biểu hiện gen pagA được tiến hành như sau:
1. Bước 1: Cắt và tinh sạch đoạn gen pagA, vector pET – TRX – FUS, 2. Bước 2: Thực hiện phản ứng lai đoạn pagA vàvector pET – TRX – FUS, 3. Bước 3: Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α,
4. Bước 4: Nuôi chủng E. Coli ở trên trong môi trường chọn lọc có chứa kanamycin,
5. Bước 5: Tách DNA plasmid, điện di DNA plasmid của những dòng khuẩn lạc này để thu được những dòng có khả năng mang gen pagA,
6. Bước 6: Biến nạp tiếp vào chủng biểu hiện E. Coli BL21,
7. Bước 7: Lựa chọn chủng, biểu hiện gen và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide,
8. Bước 8: Tìm điều kiện biểu thích hợp cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp PA,
9. Bước 9: Kiểm tra sự hòa tan của protein tái tổ hợp,
10. Bước 10: Tinh sạch protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin
11. Kiểm tra khả năng phản ứng của protein rPA với kháng thể đặc hiệu kháng PA bằng phản ứng Western blot .
2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn [30].
- Cấy khuẩn lạc vi khuẩn vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200vòng/phút ở 37o
C.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút (4oC, 10phút).
- Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa. - Bổ sung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Bổ sung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Ly tâm 12000 v , ủ -20o
).
- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu cặn, làm khô tự nhiên - Bổ sung 30- 40 µl Rnase, ủ ở 37oC trong 1 giờ, bảo quản ở -200
C.
2.3.2. Phƣơng pháp tinh sạchplasmid[30].
- Đẩy nước trong ống eppendorf có chứa DNA plasmid tách từ vi khuẩn lên 500 µl.
- Bổ sung chloroform : Isoamyl alcohol (24:1). Tỷ lệ bổ sung là 1:1, đảo nhẹ. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1/10 NaOAC hoặc KOAC (1NaOAC/ 10 dịch nổi).
- Đẩy lên 1,5 ml bằng cồn tuyệt đối, ủ ở -20oC trong 4giờ hoặc qua đêm. - Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu tủa.
- Rửa bằng 300 µl cồn 70oC, ly tâm 12000 vòng/phút. Thu cặn, làm khô tự nhiên. - Bổ sung 45 µl dH2O làm tan tủa, bảo quản ở -20o
2.3.3. Phƣơng pháp PCR
Thành phần của phản ứng PCR (25 μl):
Buffer 10X 2,5 μl
dNTPs (100 mM) 2,5 μl
BA1 (mồi xuôi) (10 pM) 1 μl
BA2 (mồi ngược) (10 pM) 1 μl
DNA 1 μl
Taq polymerase 5U 0,2 μl
H2O khử ion vô trùng 10,8 μl Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
Biến tính DNA ở 94o
C trong 5 phút
Tổng hợp (30 chu kỳ lặp lại): Biến tính: 94o
C trong 1phút. Hồi tính: 55oC 1 phút. Tổng hợp: 72oC trong 1 phút 30. Tổng hợp bổ sung ở 72oC trong 10 phút. Bảo quản ở 4oC.
2.3.4. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose [30].
Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như định lượng của acid nucleic. Phương pháp điện di dựa vào cấu trúc của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trọng lượng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel.
Các bước tiến hành điện di:
- Pha 1% agarose trong dung dịch TAE 1X, đun agarose tan hết, để nguội 50-60oC, đổ gel vào khuôn đã được đặt lược, để cho agarose đông lại.
- Nhấc lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào bể ngập bản gel 1÷2 mm.
- Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 100V. Sau khi băng điện di chạy được 2/3 bản gel thì dừng lại, nhấc bản gel ra nhuộm bằng Ethydium bromide nồng độ 2 µl/ml trong 10 phút.
- Lấy bản gel ra rửa lại bằng nước sạch sau đó soi gel trên máy để quan sát các băng DNA. Chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi gel.
Quá trình điện di có thể kéo dài hoặc trong một thời gian ngắn, nó phụ thuộc vào điện thế của thiết bị. Nếu điện thế ổn định 100 V thì thời gian điện di chỉ 25-30 phút, nhưng nếu điện thế thấp hơn 100 V thì thời gian điện di kéo dài hơn.
Thuốc nhuộm Ethydium bromide có tác dụng phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại giúp cho việc hiện hình các băng rõ ràng hơn. Dung dịch đệm (Loading Dye) lại có tác dụng làm tăng trọng lượng riêng của acid nucleic, vì vậy nó sẽ kéo phân tử acid lắng xuống đáy giếng.
2.3.5. Phƣơng pháp cắt bằng enzym giới hạn [30]
Mục đích của bước này là để kiểm tra xem DNA plasmid vừa tách chiết có mang đoạn gen pagA hay không. Sau phản ứng cắt, kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Nếu kích thước bằng với kích thước đoạn gen gắn vào vectơ chứng tỏ việc tạo dòng thành công. Ngoài ra, còn được sử dụng để xử lý đoạn gen pagA và vectơ biểu hiện tạo đầu dính, thuận lợi cho việc gắn gen vào vectơ biểu hiện.
Enzym giới hạn là những endonucleotid có khả năng thủy phân DNA mạch kép ở các vị trí có trình tự xác định.
Có 2 kiểu là cắt đầu bằng và cắt đầu so le. Ở đây sử dụng 2 enzym cắt đầu so le là BamHI và XhoI.
Vị trí cắt của XhoI:
Thành phần của phản ứng cắt như sau:
BamHI (Fermentas) 0,4 l
XhoI (Bio Lab) 0,4 l
DNA plasmid 3 l
Buffer 2 (Bio Lab) 1 l
H2O 5,2 l Thành phần phản ứng cắt lượng lớn:
Thành phần phả ứng cắt vector biểu hiện pET - TRX - FUS:
BamHI (Fermentas) 3 l
XhoI (Bio Lab) 3 l
pET - TRX - FUS 20 l
Buffer 2 (Bio lab) 3 l
Thành phần phả ứng cắt vector tái tổ hợp pCR2.1 - pagA:
BamHI (Fermentas) 2 l
XhoI (Bio Lab) 2 l
pCR2.1 - pagA 15 l
Buffer 2 (Bio lab) 2 l
2.3.6. Phƣơng pháp lai [30]
Sau khi thu được sản phẩm PCR của gen pagA, tiến hành gắn sản phẩm PCR vào vector pET - TRX - FUS với thành phần phản ứng như sau:
Tỷ lệ Insert : Vector = 3 : 1
Buffer T4 1 l
pCR2.1 - pagA 4 l
Vector pET - TRX - FUS 4 l
Để ở 140C qua đêm.
2.3.7. Phƣơng pháp tạo tế bào khả biến E. coli
Chủng E. coli DH5 được nuôi qua đêm trên môi trường LB có bổ
sung kháng sinh kanamycin ở máy lắc 370
C, 200 v/p.
Cấy chuyển 10% và tiếp tục nuôi lắc 1,5h ở 370C, 200v/p, để OD = 0,4 – 0,6.
Để 40
C trong 1h.
Ly tâm 6000 v/p (10 phút), thu tế bào và rửa bằng nước khử ion, ly tâm 6000 v/p (10 phút) thu tế bào.
Bổ sung 1ml CaCl2 0,1M, vortex, để trên đá trong 2h.
Ly tâm 6000 v/p (10 phút), thu cặn.
Bổ sung 1ml CaCl2 0,1M, vortex, để trên đá trong 1h.
Ly tâm 6000 v/p (10 phút), thu cặn.
Bổ sung 60 l CaCl2 0,1M + 30 l Glyxerol 60%.
Bảo quản ở -700
C.
2.3.8. Phƣơng pháp biến nạp vào tế bào khả biến [30]
Quá trình biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt. Các bước thực hiện như sau:
Làm tan tế bào khả biến trong đá 30 phút.
Bổ sung sản phẩm lai và để trong đá 30 phút.
Sốc nhiệt 420C trong 60 giây, chuyển nhanh sang đá.
Bổ sung 200 l môi trường LB và lắc 370C, ở 200 v/p trong 1h.
Sau đó, đem cấy trải đều 100 l trên đĩa Petri vó bổ sung kanamycin (25 mg/ml) ở nồng độ cuối là 50 g/ ml.
2.3.9. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % [30]
Điện di trên gel polyacrylamide thường được sử dụng để tách riêng các băng protein có trọng lượng phân tử khác nhau, đôi khi phương pháp này còn được dùng để tách các đoạn DNA có kích thước nhỏ (dưới 200 bp). Trong phương pháp này, gel được đổ giữa hai bản thủy tinh mỏng theo phương thẳng đứng. Công thức đổ gel polyacrylamide 12,6 %:
Gel tách: dH2O 1,968 ml Tris HCl (3M; pH 8,8) 1 ml Acrylamide – bis 30% 3,36 ml Glycerol 50 % 1,6 ml SDS 10 % 40 l APS 10 % 40 l Temed 6,4 l Gel cô: dH2O 0,85 ml Tris HCl (3M; pH 8,8) 165,25 l Acrylamide – bis 30% 212,5 l SDS 10 % 6,25 l APS 10 % 12,5 l Temed 1 l
Mẫu sau khi được xử lý với SDS buffer và biến tính (95 oC trong 10 phút) được tra vào các giếng nhỏ trong gel.
Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 300 V hoặc cường độ dòng điện là 40 mA.
Sau khi điện di xong, bản gel được gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Coomassie Brilliant Blue 0,25 %, lắc khoảng 1 giờ trên máy lắc. Sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dung dịch tẩy màu, lắc trên máy lắc khoảng 30 phút thì đổ dịch nhuộm đi cho nước vào và có thể quan sát trực tiếp.
2.3.10. Phƣơng pháp biểu hiện gen
Cấy hoạt hoá 1 khuẩn lạc trong môi trường LB có bổ sung kanamycin (25 mg/ ml) với nồng độ cuối là 50 g/ ml, nuôi lắc ở 370C qua đêm.
Cấy chuyển 1% vào 20 ml môi trường MPB có bổ sung kháng sinh
kanamycin nồng độ là 50 g/ ml và nuôi lắc ở 370C để OD đạt 0,5-0,8 (Khoảng 2-3h).
Hút 10 ml làm đối chứng trước cảm ứng và tiếp tục nuôi lắc ở 370
C trong 4h để thu mẫu không cảm ứng.
Phần còn lại, cảm ứng IPTG (100 mM) đạt 1mM, nuôi ở 370
C trong 4h.
Thu mẫu sau cảm ứng, ly tâm thu tế bào 6000 v/p trong 10 phút.
Rửa tế bào bằng nước khử ion 200 l, ly tâm 6000 v/p trong 5 phút, thu tế bào.
Bổ sung 200 l nước khử ion, làm tan tế bào.
Lấy 30 l dịch trên bổ sung thêm 5 l treatment buffer 6X.
Xử lý mẫu ở 950
C trong 10 phút.
Điện di trên gel polyacrylamide 12,6%.
Nhuộm bản gel bằng Comassie Brilliant trong 30 phút trên máy lắc.
Tẩy màu và quan sát trực tiếp.
2.3.11. Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp cho quá trình biểu hiện a, Khảo sát điều kiện nhiệt độ thời gian và thích hợp cho quá trình biểu hiện a, Khảo sát điều kiện nhiệt độ thời gian và thích hợp cho quá trình biểu hiện
Quá trình biểu hiện được thực hiện ở các nhiêt độ khác nhau (250C, 280C, 300C, 370C) với nồng độ cảm ứng IPTG (100mM) 1mM ở 370
C trong 5h và lấy mẫu theo thời gian (0, 1, 2, 3, 4, 5h) để xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen pagA
b, Khảo sát nồng độ IPTG thích hợp cho quá trình biểu hiện
Cố định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình biểu hiện gen pagA, tiến hành biểu hiện lại ở những nồng độ IPTG khác nhau, cụ thể là: 0,1 mM; 0,2 mM; 0,5 mM; 0,7 mM; 1; 2 mM.
Thu mẫu và điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid 12,6%.
2.3.12. Xác định khả năng hoà tan của protein
- Mẫu sau khi biểu hiện được ly tâm 6000 v/p trong 10 phút, thu tủa. - Rủa tế bào và ly tâm ở 6000 v/p trong 10 phút.
- Bổ sung 100 ml dung dịch C. - Ủ ở 370
C trong 30 – 60 phút.
- Siêu âm.
- Ly tâm, thu dịch pha trên (phần tan).
- Phần cặn bổ sung 1 l nước khử ion, vortex.
- l Treatment buffer 6X
- Điện di kiểm tra khả năng hòa tan của protein trên gel polyacrylamide 12,6%.
2.3.13. Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin
Protein tái tổ hợp được biểu hiện ở dạng inclusion bodies. Sử dụng phương pháp tinh sạch bằng Kit ProBond TM
của hãng invitrogen có thể chuyển protein từ dạng không hoà tan thành dạng hoà tan, điều này hết sức quan trọng cho mục đích tạo ra các protein tái tổ hợp để phát triển các Kit chuẩn đoán. Quá trình tinh sạch được thực hiện theo các bước sau:
Bƣớc 1: Chuẩn bị dịch tế bào trƣớc khi đƣa lên cột - Làm tan hoàn toàn Guanidinium Lysis Buffer
- Ly tâm huyền dịch tế bào (100 ml) đã kiểm tra khả năng biểu hiện, thu