Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu bệnh sán dây ở dê
2.4.2.1. Phương pháp mổ khám dê thu thập mẫu sán dây, định danh lồi bằng kỹ thuật hình thái học và kỹ thuật sinh học phân tử
* Định danh loài sán dây bằng kỹ thuật hình thái học
- Trong quá trình mổ khám dê, thu thập được 174 cá thể sán dây (gồm cả sán dây trưởng thành và sán dây chưa trưởng thành). Qua định loại sơ bộ thì tất cả các
cá thể sán dây đã thu được đều có hình thái giống nhau. Vì nghi ngờ chúng đều thuộc 1 lồi duy nhất nên chúng tơi đã thu thập thêm 50 cá thể sán dây ký sinh ở bò tại một số lò mổ trâu, bò của tỉnh Bắc Giang và thấy cả 50 cá thể sán dây trên bị cũng có hình thái giống nhau, nhưng khác với lồi thu được từ dê.
Để định danh lồi, chúng tơi đã quan sát hình thái, kích thước của 50 cá thể sán dây thu từ dê và 50 cá thể sán dây thu từ bị, dựa vào khóa định loại của Nguyễn Thị Kỳ (2003) [7] để có kết luận về lồi.
* Định danh lồi sán dây bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để thẩm định 5 mẫu (5 cá thể) sán dây thu từ dê và 5 mẫu (5 cá thể) sán dây thu từ bò đã được định loại bằng kỹ thuật hình thái học thường quy.
- Chọn gen đích: đoạn chèn ITS2 (the second internal transcribed spacer) của hệ gen nhân và một phần trình tự đoạn gen cox1 (the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene) của hệ gen ty thể được chọn để phân tích theo quy trình như sau:
- Tách chiết DNA tổng số:
Mẫu sán dây bảo quản trong Ethanol được rửa sạch bằng nước cất, sau đó được tách chiết DNA tổng số bằng DNeasy Tissue Kit (QIAgen) theo quy trình của nhà sản xuất như sau:
+ Cho mẫu cần tách chiết vào ống eppendorf 1,5ml,
+ Bổ sung 180µl dung dịch đệm ATL và 20 µl Proteinase K. + Ủ hỗn dịch ở 55 C/1h cho đến khi mẫu tan hồn tồn. + Bổ sung thêm 200µl đệm AL rồi trộn đều.
+ Ủ hỗn dịch ở 70oC trong 10 phút rồi trộn đều.
+ Thêm 200µl ethanol 100% và chuyển toàn bộ hỗn dịch vào cột spin. + Ly tâm tốc độ 8.000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột spin sang ống eppendoff mới.
+ Thêm 500µl đệm AW1, ly tâm 8.000 vịng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột. + Thêm tiếp 500µl đệm AW2 rồi ly tâm 13.000 vịng/phút trong 3 phút.
+ Đặt cột spin vào ống eppendorf 1,5ml rồi bổ sung thêm 200 µl dung dịch đệm AE, để yên tại nhiệt độ phịng trong 1 phút sau đó ly tâm 8000 vịng/phút trong 1 phút.
- Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn, sử dụng cặp mồi 3S và A28 (Bowles and McManus, 1993; Bowles et al., 1993) cho trình tự ITS2 và cặp mồi JB3 và JB4.5 (Bowles et al., 1993) cho trình tự cox1, với thành phần phản ứng và điều kiện như sau:
Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR TT 1 2 3 4 5 6 Thành phần
Master Mix Dream Taq Green 2X MgCl2 25mM
Primer (xuôi và ngược) (10pmol) Taq DNA polymerase 5u/µl Nước cất khử ion DNA tổng số 10 ng/ml Tổng thể tích Thể tích (µl) 25 1 1,25 0,5 20 2 50 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: biến tính ở 95oC/3 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ - 95oC/30 giây, 54oC/1 phút, 72oC/1 phút, và kết thúc 72oC/10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR system 9700.
- Điện di kiểm tra kết quả PCR trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide và soi đèn UV. Cách tiến hành như sau:
+ Chuẩn bị gel agarose 1%: cân 0,5 gram agarose cho vào cốc đong chịu nhiệt rồi cho 50 ml dung dịch đệm TBE 1X vào cốc. Cho vào lị vi sóng đun đến khi agarose tan chảy hết. Bổ sung 5µl ethidium bromide (10mg/ml) vào, rồi đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di đã gài lược có răng tạo giếng đến ngập răng lược khoảng 0,5 cm, để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi thạch nguội chuyển miếng thạch vào hộp điện di chứa đệm TAE 1X, bổ sung đệm sao cho dung dịch đệm ngập bản gel.
+ Tra mẫu: lấy 5µl sản phẩm trộn với 2µl loading buffer tra vào từng giếng trên gel.
+ Tra chỉ thị phân tử (DNA marker): tra 5µl chỉ thị phân tử vào giếng chứa thang chuẩn.
+ Chạy điện di ở 100 - 120V trong 20 - 30 phút. + Rửa sạch bằng nước cất, soi qua tia cực tím.
- Tinh khiết sản phẩm PCR bằng bộ hóa chất QIAquick PCR purification kit (QIAGEN Inc. Mỹ) theo quy trình như sau:
+ Thêm 200µl PB vào 40µl sản phẩm rồi trộn đều.
+ Chuyển cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột. + Thêm 750µl PE, ly tâm 13000 vịng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột. + Ly tâm tiếp 13000 vòng/1 phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột.
+ Chuyển cột sang ống eppendorf mới, thêm 30µl dung dịch EB, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Sản phẩm PCR tinh sạch thu nhận và giữ ở -200C cho đến khi sử dụng.
Sản phẩm PCR được đọc trình tự tại cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR bằng máy tự động Ab 3730 DNA
Analyzer, sử dụng BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit. - Phân tích trình tự gen và vẽ cây phả hệ phát sinh lồi
Tổng số 20 trình tự (10 trình tự ITS2 của 5 mẫu sán dây từ dê và 10 trình tự ITS2 của 5 mẫu sán dây từ bị) đã được xác định. Những trình tự này đã đăng ký trên ngân hàng Gene (GenBank) với mã số truy cập LC422625 - LC422636 và
LC459960 - LC459967 . Ngồi ra, trình tự của 2 lồi M. expansa và M. benedeni từ các nước khác trong dữ liệu ngân hàng gene được sử dụng để phân tích. Trình tự ITS2 (AJ578153) của lồi Anoplocephala perfoliata và trình tự cox1 (EU446629) của lồi Anoplocephaloides dentata được dùng là trình tự ngồi nhóm (out-group).
Sử dụng phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), để xử lý, phân tích bộ số liệu trình tự gen và xây dựng cây phả hệ phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) với mơ hình thích hợp nhất. Độ tin cậy của các nhóm được đánh giá bằng giá trị bootstrap với 1000 mẫu lặp.
2.4.2.2. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm sán dây ở dê
- Xét nghiệm mẫu phân dê tìm đốt sán dây theo phương pháp lắng cặn Benedek (1943). Những mẫu phân tìm thấy đốt sán dây được đánh giá là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm. Tỷ lệ nhiễm được xác định bằng số dê nhiễm sán dây trong tổng số dê xét nghiệm phân.
- Cường độ nhiễm sán dây qua xét nghiệm phân được xác định bằng số lượng đốt sán/lần thải phân, đếm tất cả những đốt sán có trong 1 lần thải phân của dê.
Quy định 3 mức cường độ nhiễm sán dây qua xét nghiệm phân tìm đốt sán: + Mức 1: ≤ 10 đốt sán/lần thải phân.
+ Mức 2: > 10 - 20 đốt sán/lần thải phân. + Mức 3: > 20 đốt sán/lần thải phân.
- Cường độ nhiễm sán dây qua mổ khám được xác định bằng số sán dây/dê, đếm toàn bộ số sán dây ký sinh trong ruột non của dê.
Quy định 3 mức cường độ nhiễm sán dây qua mổ khám: + Mức 1: ≤ 2 sán dây/dê.
+ Mức 2: > 2 - 5 sán dây/dê. + Mức 3: > 5 sán dây/dê.
2.4.2.3. So sánh nguy cơ dê nhiễm sán dây theo phương thức chăn nuôi
- Yếu tố nguy cơ 1: chăn nuôi theo phương thức truyền thống. - Yếu tố nguy cơ 2: chăn nuôi theo phương thức bán công nghiệp.
Dùng chỉ số nguy cơ tương đối (Relative Risk - RR) và tỷ số giữa 2 xác suất (Odds ratio - OR) để so sánh các nguy cơ nói trên.
Áp dụng phương pháp phân tích dịch tễ theo tài liệu của Nguyễn Như Thanh và cs. (2001) [22], khả năng nhiễm bệnh đối với một yếu tố nguy cơ được tính tốn qua bảng sau
Yếu tố nguy cơ Nhiễm bệnh
Có Khơng Cộng
Có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ Khơng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ
Cộng a c a+c b d b+d a+b c+d a+b+c+d Trong đó:
a: Số dê nhiễm sán dây, có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ
b: Số dê khơng nhiễm sán dây, nhưng có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ c: Số dê nhiễm sán dây, nhưng không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ d: Số dê không nhiễm sán dây, và không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ Nguy cơ tương đối được tính theo cơng thức sau:
Trong đó:
p1 : tỷ lệ nhiễm bệnh khi tiếp xúc với yếu tố nguy cơ
Đánh giá kết quả:
+ Nếu RR > 1 yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng nhiễm bệnh
+ Nếu RR = 1 khơng có mối liên hệ giữa yếu tố nguy cơ và khả năng nhiễm bệnh + Nếu RR < 1 yếu tố nguy cơ làm giảm khả năng nhiễm bệnh.
+ OR > 1: khả năng nhiễm bệnh cao hơn khả năng không nhiễm bệnh.
+ OR = 1 khả năng nhiễm bệnh tương đương với khả năng không nhiễm bệnh. + OR < 1: khả năng nhiễm bệnh thấp hơn khả năng không nhiễm bệnh.
2.4.2.4. Phương pháp nghiên cứu về nhện đất - vật chủ trung gian của sán dây Moniezia
* Phương pháp thu thập nhện đất họ Oribatidae
- Mẫu đất của lớp đất bề mặt (dày 10 cm) được lấy ở những nông hộ nuôi dê và ở bãi chăn thả dê, với kích thước của mỗi mẫu thu là 5 x 5 x 10 cm. Tất cả các mẫu sau khi thu được ở thực địa đều cho ngay vào túi nilon riêng, có nhãn ghi những thơng tin cần thiết (địa điểm, ngày, tháng lấy mẫu...) rồi buộc chặt lại. Các mẫu thu được trong cùng một tầng đất được để vào một túi nilon to, để khỏi lẫn và đỡ mất thời gian tách lọc.
- Tiến hành tách nhện đất Oribatidae theo phương pháp phễu lọc “Berlese Tullgren” [17] dựa theo tập tính hướng sáng âm và chui sâu xuống đất khi các lớp trên bị khô dần. Các mẫu bị khô dần từ lớp mặt, nhện đất sẽ chui sâu xuống lớp đất phía dưới, qua lưới lọc, rơi xuống phễu và trượt theo thành phễu rồi xuống ống thu mẫu (ống thu mẫu có dung dịch định hình là cồn etylic 70o hoặc formol 4%).
* Phương pháp xác định loài nhện đất họ Oribatidae và xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán dây trong nhện đất
Mẫu nhện đất họ Oribatidae trước khi định loại được tẩy màu, làm trong lớp vỏ kitin cứng. Q trình làm trong mẫu có thể diễn ra trong một vài ngày hoặc lâu hơn nên cần nhặt Oribatidae riêng ra một lam kính lõm. Quan sát lam kính dưới kính lúp: dựa vào đặc điểm hình dạng ngồi, dùng kim tách sơ bộ chúng thành nhóm riêng có hình thù giống nhau. Đặt lamen ở bên trái lam kính sao cho chỉ phủ một phần chỗ lõm. Dùng kim chuyển từng Oribatidae vào chỗ lõm dưới lamen để quan sát các tư thế khác nhau theo hướng lưng bụng và ngược lại. Khi đã đặt mẫu ở đúng tư thế quan sát thì chuyển sang quan sát dưới kính hiển vi. Đầu tiên quan sát ở độ phóng đại thấp, sau đó chuyển sang độ phóng đại lớn hơn, sao cho phù hợp để quan sát được cấu trúc của nhện đất.
Định loại nhện đất theo tài liệu của Vũ Quang Mạnh (2007) [18]. Chụp ảnh siêu cấu trúc của nhện đất dưới kính hiển vi điện tử quét.
Sau khi định danh loài nhện xong, nghiền nát từng cá thể nhện, kiểm tra dưới kính hiển vi để tìm ấu trùng Cysticercoid của sán dây Moniezia, từ đó xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng.
* Phương pháp gây nhiễm ấu trùng sán dây Moniezia cho nhện đất Oribatidae và xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng ở nhện đất sau khi gây nhiễm
Dùng phương pháp lắng cặn Benedek để thu thập một số lượng lớn đốt sán già từ phân dê mới thải và phương pháp mổ khám để thu thập đốt sán già từ dê bị bệnh sán dây. Sử dụng những đốt sán này để gây nhiễm cho nhện đất.
Tiến hành thu thập nhện đất, cứ 3 ngày thu mẫu 1 lần, tách riêng từng loại nhện để ni trong bình thủy tinh có giữ ẩm. Chọn những đốt sán dây già, nghiền vỡ để giải phóng trứng, kiểm tra hình thái cấu tạo của trứng trước khi gây nhiễm. Trứng gây nhiễm phải là trứng già, có hình 3 cạnh hoặc 4 cạnh, bên trong có phơi 6 móc. Hỗn hợp trứng sán dây với mảnh vụn lá cây khơ rồi đặt vào trong bình thủy tinh có nhện đất. Theo Narsapur V. S. và cs. (1979), Polec W. và cs. (1994): sau 27 - 29 ngày gây nhiễm ấu trùng sán dây cho nhện đất thì đã thu được ấu trùng có sức gây bệnh. Do đó, từ ngày thứ 27 sau gây nhiễm cho nhện đất tại Bắc Giang, tiến hành nghiền từng cá thể nhện đất để tìm ấu trùng sán dây Moniezia. Từ đó xác định được tỷ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng của nhện đất.
2.4.2.5. Phương pháp xây dựng bản đồ dịch tễ
Bản đồ dịch tễ sự lưu hành bệnh sán dây trên đàn dê ở 5 huyện tại tỉnh Bắc Giang được xây dựng theo kỹ thuật GIS gồm các bước sau:
* Xây dựng phần mềm bản đồ:
- Thu thập thông tin, xây dựng cơ sở dữ liệu bản đồ. - Xây dựng phần mềm biên dịch dữ liệu thu thập. - Xây dựng phần mềm hiển thị thông tin trên bản đồ.
* Biên tập bản đồ giấy:
- Biên tập bản đồ giấy tỷ lệ 1:100.000.
Tiến hành xây dựng bản đồ dịch tễ sự lưu hành bệnh sán dây trên dê tại 25 xã, của 5 huyện thuộc tỉnh Bắc Giang.
Quy trình xây dựng dữ liệu bản đồ dịch tễ sự lưu hành bệnh sán dây bằng công nghệ GIS được tiến hành theo trình tự sau:
Nguồn dữ liệu
- Bản đồ
- Tài liệu, số liệu thực địa
Chuẩn hóa dữ liệu
- Phân lớp đối tượng bản đồ - Làm sạch dữ liệu
Thiết kế Geodatabase
Tạo cơ sở dữ liệu bản đồ * Dữ liệu đầu vào
Căn cứ vào thực trạng các loại tài liệu bản đồ, trên cơ sở bản đồ hiện trạng sử dụng đất, tỷ lệ 1:100.000 của các huyện, tiến hành đánh giá về tư liệu chuẩn bị cho việc xây dựng bản đồ, kết hợp với kết quả điều tra thực địa về vị trí các khu vực dê nhiễm bệnh trên địa bàn các xã. Đây là những căn cứ dữ liệu đầu vào để tiến hành xây dựng bản đồ.
* Chuẩn hóa dữ liệu khơng gian bằng phần mềm Micrrostation
Từ dữ liệu bản đồ đã thu thập được, sử dụng các phần mềm Microstation chọn các đối tượng bản đồ có cùng thuộc tính để phân theo các nhóm đối tượng, thực hiện việc làm sạch dữ liệu, kiểm tra và sửa lỗi các đối tượng bản đồ bằng các công cụ trong phần mềm Microstation.
Sau khi nhập đầy đủ các thông tin về tỷ lệ mắc bệnh sán dây trên dê vào cơ sở dữ liệu, trình bày các nội dung của bản đồ. Kết quả là vị trí các khu vực có dê mắc bệnh đồng thời được cập nhật lên bản đồ.
2.4.2.6. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý, lâm sàng của bệnh sán dây ở dê
* Phương pháp gây nhiễm cho dê
Nghiền từng cá thể nhện đất đã gây nhiễm ấu trùng sán dây Moniezia, đếm số lượng ấu trùng sán dây có sức gây bệnh trong nhện đất. Từ đó có cơ sở để tính liều gây nhiễm cho dê.
Bố trí thí nghiệm gây nhiễm sán dây cho dê:
- Đợt 1: gây nhiễm để nghiên cứu một số đặc điểm của bệnh sán dây Moniezia. Chọn 5 dê con 5 tháng tuổi khỏe mạnh từ những hộ chăn nuôi tốt, không bị nhiễm sán dây và các ký sinh trùng khác. Mỗi dê được nhốt riêng trong một ô chuồng.
Theo dõi trong 1 tuần về tình trạng sức khỏe, đồng thời xét nghiệm phân của từng dê để đảm bảo chắc chắn dê khỏe và khơng nhiễm giun, sán. Sau đó, chia 5 dê thành 2 lô:
Lô gây nhiễm: gồm 3 dê, cho dê nuốt số nhện đất chứa ấu trùng sán dây có sức gây bệnh (đảm bảo liều gây nhiễm là 200 ấu trùng/dê).
Lơ đối chứng: gồm 2 dê khơng gây nhiễm.
Thí nghiệm gây nhiễm sán dây Moniezia cho dê được bố trí như sau: