CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.2.2. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu được trình bày ở hình 2.3.
Trước tiên, củ đảng sâm (C. javanica) ở dạng hỗn hợp nguyên liệu ở nhiều giai đoạn sinh trưởng khác nhau, được thu mẫu tại 3 xã Đạ Sa, Đạ Nhim và Đạ Chais, huyện Lạc Dương, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 5, 6 hàng năm trong giai đoạn 2016÷2019. Sau khi thu mẫu tiến hành phân loại và đánh giá độ tuổi. Để có thể phân loại chính xác độ tuổi nguyên liệu, luận án tiến hành phân tích các đặc điểm hình thái và cấu trúc mơ để tìm ra quy luật và mối liên quan giữa đặc điểm hình thái và giải phẫu mô củ. Đồng thời, luận án tiến hành đánh giá thành phần các chất có trong củ đẳng sâm và đối chiếu với tiêu chuẩn dược liệu theo DĐVN, V (2017) để xác định được thời gian thu hoạch củ đẳng sâm tự nhiên có chất lượng đạt chuẩn để sử dụng trong nghiên cứu. Sau đó, luận án sẽ thu mẫu theo độ tuổi đã lựa chọn và tiến hành xử lý, cắt lát, sấy khơ đóng bao bì
PA hút chân khơng 100% để dùng làm ngun liệu trong suốt quá trình nghiên cứu. Trong các loại củ thực vật thường được bao phủ bên ngoài bằng lớp sáp, chính lớp chất béo này sẽ ngăn cản quá trình chiết các chất. Do vậy, luận án tiến hành xử lý loại chất béo ra khỏi mẫu khô bằng dung mơi hữu cơ (n- hexan), sau đó xử lý loại đường tự
do và các chất màu trong nguyên liệu bằng cách ngâm hồi lưu nguyên liệu bằng ethanol 90%. Phần dược liệu đã xử lý sẽ được sấy khô để dùng cho nghiên cứu chiết inulin.
36
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Quá trình chiết inulin sẽ được tối ưu hóa theo hàm mục tiêu hàm lượng inulin,
fructan và chất chiết hòa tan cao nhất. Kết quả tối ưu hóa là cơ sở để xác định các thơng
số tối ưu cho q trình chiết inulin (nhiệt độ chiết, thời gian chiết; tỉ lệ dung môi và nguyên liệu (DM/NL) làm cơ sở đề xuất quy trình chiết inulin từ đảng sâm.
Tiếp theo, tiến hành chiết inulin từ đảng sâm theo quy trình đề xuất và nghiên cứu
Đánh giá độ tuổi dựa vào đặc điểm hình thái và giải phẫu mơ củ
Định tính và định lượng một số nhóm chất
Nghiên cứu chiết inulin Nghiên cứu kết tủa inulin
Xác định cấu trúc và KL phân tử Inulin Tối ưu hóa theo mơ hình Box-Benkhen Củ đẳng sâm tự nhiên
Củ đẳng sâm đạt tiêu chuẩn
Dung môi hữu cơ Xử lý
DƯỢC LIỆU ĐÃ XỬ LÝ
Xác định tác nhân và điều kiện kết tủa Tinh sạch inulin
Xác định các thơng số thích hợp cho q
trình sấy phun (chất mang, nồng độ chất
mang, nhiệt độ sấy).
Sấy phun
Chế phẩm bột đảng sâm
Phối trộn tạo synbiotic Tối ưu hóa q trình phối trộn theo thiết kế Mix-design, mơ hình D-Optimal
Chế phẩm synbiotic synbiotic
37
xác định tác nhân kết tủa inulin, nồng độ tác nhân kết tủa để thu được inulin với hàm lượng cao nhất. Sau đó, luận án tiến hành nghiên cứu tinh sạch inulin và xác định khối lượng phân tử inulin. Trên cơ sở kếtquả khảo sát sơ bộ và tổng quan tài liệu nghiên cứu về các phương pháp tinh sạch cho thấy phương pháp tinh sạch inulin bằng cách kết tinh lại inulin nhiều lần trong dung môi ethanol là kỹ thuật phù hợp với quá trình tinh sạch
inulin. Do vậy, luận án ứng dụng phương pháp kết tinh lại nhiều lần để tinh sạch Inulin.
Trong quá tinh sạch trước tiên dịch chiết inulin được cô đặc chân không đến
16oBx. Sau đó, dịch cơ đặc được sử dụng để kết tủa thu hồi bột saccharide thô và sử dụng bột saccharide thô để tinh sạch inulin bằng phương pháp kết tinh lại inulin nhiều lần trong dung môi ethanol. Inulin tinh sạch thu được sẽ được dùng để xác định khối lượng phân tử và cấu trúc dựa trên phân tích khối phổ FT-IR, MNR, HSQC, HMBC.
Đồng thời, luận án sẽ tiến hành nghiên cứu xác định thơng số thích hợp cho q trình sấy phun tạo bột củ đẳng sâm như loại chất mang, nồng độ chất mang, nhiệt độ sấy.
Luận án tiếp tục tiến hành đánh giá các đặc tính của bột củ đẳng sâm và khảo sát
hoạt tính prebiotic của bột củ đẳng sâm làm cơ sở cho việc ứng dụng bột inulin củ đảng
sâm trong sản xuất synbiotic. Sau đó, luận án tiếp tục tiến hành nghiên cứu tối ưu hố
q trình phối trộn bột đảng sâm với sinh khối vi khuẩn lactic tạo ra sản phẩm synbiotic.
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu ở trên, luận án sẽ tiến hành đề xuất quy trình tạo sản
phẩm synbiotic.
Bột synbiotic thành phẩm được sử dụng để thử nghiệm độc tính cấp, độc tính bán trường diễn trên chuột thí nghiệm để xác định tính an tồn, đặc tính hỗ trợ điều trị tiêu chảy và đặc tính tăng cường miễn dịch làm cơ sở định hướng ứng dụng cho con người
sau này.
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định một sốcơng đoạn chính 2.2.3.1. Tối ưu hóa q trình chiết