1.2 Phƣơng pháp chiết tách hợp chất tự nhiên
1.2.2.4 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất
Các dung môi cần đƣợc chƣng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy tinh do trong dung môi thƣờng hay chứa một số tạp bẩn mà thƣờng gặp nhất là chất dẻo hóa. Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thƣờng đƣợc chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo.
Methanol và chloroform thƣờng chứa tạp chất là di(2-ethylhexyl) phtalate và chất này thƣờng bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang khảo sát.
Chloroform, dichloromethane có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid nhƣ brucin, strychnin, ephedrin, … Để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác. Tƣơng tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nƣớc, sự đồng phân hoá cho vài hợp chất hữu cơ.
Diethyl ether ít đƣợc sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sơi thấp dễ cháy, độc, có thể gây mê cho ngƣời sử dụng và có khuynh hƣớng tạo thành peroxide dễ gây nổ. Peroxide này rất hoạt tính, có thể oxid hố các hợp chất mang nhiều nối đôi liên hợp nhƣ carotenoid.
Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonide nếu hợp chất chiết có chứa nhóm
cis-1,2-diol hiện diện trong môi trƣờng acid.
Chiết bằng môi trƣờng acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycoside (môi trƣờng acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phần đƣờng) hoặc cắt đứt nối ester (môi trƣờng kiềm) hoặc tạo ra sự chuyển vị.
Sau khi chiết, dung môi đƣợc thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30-40C, chƣng cất ở nhiệt độ cao có thể làm hƣ một số hợp chất kém bền nhiệt.
1.2.2.5 Sự hịa tan của hợp chất vào dung mơi
Dựa vào tính phân cực của dung mơi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự đốn sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết.
Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể có các hydrocacbon béo và thơm (nhƣ triglyceride, alkane mạch carbon dài, alcol béo, ester béo, acid béo, …), các thành phần của tinh dầu (monoterpen, sesquiterpen, một vài
diterpen bay hơi đƣợc), các sterol thực vật (phytosterols), các chất màu thực vật nhƣ caroten, …
Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: có thể có các sesquiterpen, diterpen, coumarin, quinon, các aglycon do hợp chất glycoside bị thủy giải, các monoglycosid (chỉ mang một phân tử đƣờng), một số alkaloid loại base yếu.
Trong cao methanol hoặc cao nƣớc: có thể có các chất màu thực vật nhƣ clorophyl, các glycosid (saponin), các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp với các acid hữu cơ, các muối amine, các tannin, các hydrat cacbon có trọng lƣợng phân tử nhỏ nhƣ monosaccharide, oligosaccharide, các protein thực vật, các muối vô cơ, một số polysaccharide nhƣ: pectin, chất nhầy, chất gôm, …
1.2.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phƣơng pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng.
1.2.3.1 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng
a. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dƣới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dƣới để hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để dung mơi tinh khiết.
Phƣơng pháp thực hiện: bột cây đƣợc xây thô, lọt đƣợc qua lỗ rây 3 mm. Đáy của bình ngấm kiệt đƣợc lót bằng bơng thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây đƣợc đặt vào bình, lên trên lớp bơng thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bơng bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung mơi cần chiết vào bình cho đến khi dung mơi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt, có thể sử dụng dung mơi nóng hoặc nguội.
Để yên sau một thời gian, thƣờng là 12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung mơi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình.
Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có cịn để lại vết gì trên mặt kiếng hay khơng, nếu khơng cịn vết gì là đã chiết kiệt.
b. Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tƣơng tự nhƣ kỹ thật chiết ngấm kiệt nhƣng khơng địi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lƣợng lớn mẫu cây.
Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép khơng gỉ, hình trụ đứng, có nắp đậy. Phƣơng pháp thực hiện: bột cây đƣợc đặt vào bình, rót dung mơi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hịa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết đƣợc lọc ngang qua một tờ giấy lọc, cơ quay thu hồi dung mơi sẽ có đƣợc cao chiết. Tiếp theo, rót dung mơi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài).
Mỗi lần ngâm dung mơi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lƣợng dung mơi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hịa tan vào dung mơi đến đạt mức bão hịa, khơng thể thêm đƣợc nhiều hơn nên có ngâm lâu cũng chỉ làm mất thời gian.
Dung môi sau khi thu hồi đƣợc làm khan nƣớc bằng các chất làm khan và đƣợc tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.
Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng đƣợc áp dụng nhiều, gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết soxhlet, … Ngồi ra, cịn có sự chiết với phƣơng pháp lôi cuốn hơi nƣớc, phƣơng pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn.
1.2.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng
Kỹ thuật chiết lỏng lỏng thƣờng đƣợc áp dụng để: chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu, phân chia cao alcol thơ ban đầu có chứa q nhiều loại hợp
chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc của sự chiết là dung mơi khơng phân cực (thí dụ petroleum ether) sẽ hồ tan tốt các hợp chất khơng phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo, …), dung mơi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichlorometan…) hồ tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether -O-, aldehyde -CHO, cetone -CO-, ester -COO-, …) và dung môi phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức -OH, -COOH, …).
Việc chiết lỏng-lỏng đƣợc thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thơ ban đầu đƣợc hồ tan vào pha nƣớc. Sử dụng lần lƣợt các dung mơi hữu cơ, loại khơng hồ tan với nƣớc hoặc loại có thể hỗn hợp đƣợc với nƣớc để chiết ra khỏi pha nƣớc các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi). Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nƣớc mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dƣới so với pha nƣớc.
Việc chiết đƣợc thực hiện lần lƣợt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung mơi phân cực thí dụ nhƣ: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, … Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết đƣợc thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lƣợng nhỏ thể tích dung mơi, chiết đến khi khơng cịn chất hịa tan vào dung mơi thì đổi sang chiết với dung mơi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết đƣợc gom chung lại, làm khan nƣớc với các chất làm khan nhƣ Na2SO4, MgSO4, CaSO4, … đuổi dung môi ta thu đƣợc cao chiết.
Để kiểm tra xem các hợp chất nào đã đƣợc chiết vào pha hữu cơ cũng nhƣ các hợp chất nào còn lại ở trong pha nƣớc và chiết bao nhiêu lần thì hồn tất, có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nƣớc và của pha hữu cơ. Sự chiết bởi một dung mơi cụ thể nào đó đƣợc gọi là hồn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng khơng cịn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nƣớc cũng nhƣ trong pha hữu cơ. Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung mơi, khơng cịn để lại vết gì trên mặt kiếng.
Cần lƣu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung mơi thì khả năng hịa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi.
Hình 6 Sự tách lớp trong quá trình chiết lỏng-lỏng
1.3 Các phƣơng pháp sắc ký
1.3.1 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) còn gọi là sắc ký bản mỏng hay sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tƣợng hấp phụ. Trong đó, pha động là dung mơi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ nhƣ: silica gel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ đƣợc tráng thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này đƣợc gọi là sắc ký lớp mỏng (TLC).
1.3.1.1 Nguyên lý của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Trong sắc ký lớp mỏng có 4 cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, nhƣng cơ chế hấp phụ chiếm phần lớn. Các chất cần tách trong TLC có thể khuếch tán theo cả chiều dọc và chiều ngang đối với phƣơng chuyển động của dung môi. Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong
quá trình di chuyển mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại những vị trí khác nhau.
1.3.1.2 Chất hấp phụ
a. Hiện tƣợng hấp phụ
Hiện tƣợng hấp phụ là sự tích tụ một chất ở thể khí hoặc trong dung dịch trên bề mặt một chất rắn. Hiện tƣợng này xảy ra trên bề mặt, do đó độ mịn của chất hấp phụ có tầm quan trọng ảnh hƣởng đến mức độ phân tách sắc ký hấp phụ.
b. Chất hấp phụ
Các chất hấp phụ đƣợc dùng trong sắc ký lớp mỏng hầu hết là các oxit khơng tan, các oxit hydrate hóa và các muối.
Một số chất hấp phụ đƣợc dùng nhƣ: saccharose, Na2CO3, CaCO3, MgCO3,
MgO, … Trong phân tích dƣợc liệu, chất hấp phụ thông dụng nhất là silica gel và nhơm oxit.
1.3.1.3 Chấm chất phân tích
Cho mẫu phân tích vào một dung mơi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm chất này thành một vết nhỏ, gọn lên tấm bảng mỏng.
Yêu cầu đối với vết chấm:
Vết chấm phải nhỏ và đều nhau.
Lƣợng chất phải đồng đều nhau giữa các vết chấm.
Khoảng cách giữa các vết chấm đều nhau. Để đạt đƣợc các u cầu trên thì ta phải:
Hịa tan chất thử vào dung môi dễ bay hơi.
Dịch chấm có nồng độ vừa phải, khơng lỗng q hay đặc quá.
Que chấm (ống mao quản) bé và đều nhau.
Nếu có điều kiện thì đặt tấm bảng mỏng lên trên một mặt phẳng kim loại nóng để bốc hơi nhanh dung mơi hoặc dùng máy sấy tóc để hơ nóng vết chấm sau mỗi lần chấm, nếu khơng thì ta dùng miệng để thổi cho dung môi bay hơi nhanh hơn.
Sau khi chấm hoàn tất, nhúng bản mỏng vào dung môi giải ly đƣợc đặt trong bình kín.
1.3.1.4 Giải ly bản mỏng
a. Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình có kích thƣớc lớn hơn một chút so với kích thƣớc của bản mỏng. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì nhƣ thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất. Cho dung mơi hoặc hỗn hợp dung mơi vào bình, với sắc ký lớp mỏng định tính, chỉ cần một thể tích khoảng 10 mL dung mơi. Chiều cao của lớp dung mơi trong bình khơng đƣợc cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bảng mỏng (vết chấm trên bảng mỏng không đƣợc ngập vào trong dung môi khi vừa mới thả bản vào bình).
Bình triển khai bản mỏng yêu cầu phải:
Kín
Đáy bằng và khơng rộng lắm.
Có giấy lọc dùng bảo hịa dung mơi trong bình.
Cho dung mơi bảo hịa bình một thời gian trƣớc khi đặt bản mỏng vào.
Trong quá trình giải ly khơng di chuyển bình, đặt bình vào nơi kín gió.
Đong dung mơi đúng tỉ lệ đã định và trộn thật đều trƣớc khi rót vào bình.
Hình 7 Giải ly bản mỏng
b. Các kỹ thuật giải ly bản mỏng
Sau khi bình đã bảo hịa dung mơi, ngƣời ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở phía trên cao, gần với nắp đậy bình. Ở phía trên cao của bình triển khai, có một máng nhỏ chứa dung mơi giải ly. Ngƣời ta cho một tờ giấy lọc (có chiều ngang bằng chiều ngang của tấm bảng mỏng) vắt ngang từ máng qua tấm lớp mỏng, để dung môi từ máng di chuyển đến cạnh đầu trên của tấm lớp mỏng rồi đi xuống dƣới thấp.
Dung môi giải ly di chuyển lên
Sau khi bình đã bảo hịa dung mơi, ngƣời ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dƣới gần đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0.5-1 cm.
Giải ly nhiều lần liên tiếp
Kỹ thuật đƣợc áp dụng để tách mẫu có chứa các hợp chất có Rf gần sát nhau, thực hiện bằng cách giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đã chọn. Mỗi lần giải ly xong, lấy bản ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa.
Giải ly hai chiều
Trên tấm sắc ký bản mỏng hình vng, thí dụ 2020 cm, chấm dung dịch mẫu cần phân tích lên góc phải, cách hai bìa một khoảng 2-3 cm, giải ly với hệ dung môi X. Lấy bản ra, sấy khô và xoay bản 90, đặt trở lại bình sắc ký để đƣợc giải ly với hệ dung mơi Y.
1.3.1.5 Hiện hình các vết sau khi giải ly
Sau khi giải ly xong, các vết có màu sẽ đƣợc phát hiện bằng mắt thƣờng, nhƣng phần lớn các hợp chất hữu cơ khơng có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phƣơng pháp hóa học hoặc vật lý.
a. Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp thông dụng nhất là phát hiện bằng tia tử ngoại (UV). Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sát bản mỏng bằng tia UV, dụng cụ này có gắn hai bóng đèn UV với hai loại bƣớc sóng là 254 nm và 366 nm.
Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV. Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm. Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng
này dùng để phát hiện hợp chất có phát huỳnh quang. Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu.
b. Phƣơng pháp hóa học
Phƣơng pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung mơi thích hợp rồi phun xịt thuốc thử này lên bản mỏng hoặc nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử.
Các thuốc thử đƣợc xếp thành hai loại:
Thuốc thử khơng đặc trƣng: khi nó tạo vết có màu với hầu hết các loại hợp chất hữu cơ, thí dụ: iodo, sulfuric acid, chất chỉ thị phát huỳnh quang, …
Thuốc thử đặc trƣng: chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa những nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trƣng, thí dụ: thuốc thử