Cách xác định:
Chuẩn bị 3 chén sứ sạch, đánh dấu và sấy trong tủ sấy đến nhiệt độ lớn hơn 100C. Sau khi sấy đặt chén vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độphịng. Cân chén sứ có khối lƣợng m1.
Cho vào mỗi chén m gam mẫu sấy ở nhiệt độ bằng 100C, sau 5 giờ lấy ra, cứ nhƣ vậy đến khi khối lƣợng m2 của mẫu và chén không đổi.
Độ ẩm của mỗi mẫu đƣợc tính theo cơng thức: 100% m m m m (%) W 1 2 Độ ẩm của mẫu: 3 (%) W (%) W 1 3 Kết quả: 8.819% 3 8.835% 9.07% 8.552% W 8.835% 100% 1.562 25.001 1.562 23.577 W 9.07% 100% 1.521 25.101 1.521 23.718 W 8.552% 100% 1.485 24.932 1.485 23.574 W 3 2 1
Kết luận: Độ ẩm của mẫu vỏ Tràm xay nhỏ là 8.819% 3.3 Định tính sơ bộ cao tổng
3.3.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid
Để phát hiện sự hiện diện của alkaloid trong cây ngƣời ta thƣờng áp dụng cách sau: 5 g bột cây xay nhuyễn và dung dịch nƣớc 1% H2SO4 đƣợc cho vào erlen và đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc, lấy dịch lọc để thử với thuốc thử alkaloid.
3.3.1.1 Thuốc thử alkaloid
a. Thuốc thử Mayer
Dung dịch A: hòa tan 1.36 g HgCl2 trong 60 mL nƣớc cất.
Dung dịch A + dung dịch B + 30 mL nƣớc cất = dung dịch thuốc thử Mayer.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid, nếu có
alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
b. Thuốc thử Dragendorff
Dung dịch A: hòa tan 8 g Bi(NO3)3.H2O trong 25 mL HNO3 30%.
Dung dịch B: hòa tan 28 g KI và 1 mL HCl 6 N trong 5 mL nƣớc cất.
Hỗn hợp A + B, để yên trong tủ lạnh 5°C cho kết tủa màu sậm và tan trở lại, lọc, thêm nƣớc cất cho đủ 100 ml. Hỗn hợp màu nâu đỏ đƣợc chứa trong chai màu nâu để che ánh sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu trong vài tuần.
Thuốc thử này cho kết tủa màu cam nâu với dung dịch acid lỗng có chứa alkaloid.
3.3.1.2 Kết quả định tính alkaloid
Hình 12 Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer
1. Mẫu thử
2. Mẫu sau khi cho thuốc thử Mayer
Nhận xét: có xuất hiện tủa màu vàng nhạt.
Hình 13 Định tính alkaloid với thuốc thử
Dragendorff
1. Mẫu thử
2. Mẫu sau khi cho thuốc thử Dragendorff vào
Nhận xét: có xuất hiện kết tủa màu nâu cam Kết luận: trong cao tổng có sự hiện diện của alkaloid.
3.3.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 3.3.2.1 Thuốc thử flavonoid
Nhỏ dung dịch (CH3COO)2Pb bão hòa vào 1 ống nghiệm có dịch chứa flavon/ethanol sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng xanh.
b. Thuốc thử sắt (III) clorua FeCl3
Nhỏ dung dịch FeCl3 vào 1 ống nghiệm có dịch chứa flavon/ethanol sẽ xuất hiện kết tủa màu xanh lục đôi khi màu nâu đỏ.
c. Thuốc thử H2SO4 đậm đặc
Nhỏ dung dịch H2SO4 đậm đặc vào 1 ống nghiệm có dịch chứa flavon/ethanol sẽ xuất hiện kết tủa màu vàng đậm đến cam, màu đỏ hoặc xanh dƣơng đỏ, hoặc màu từ cam đến đỏ.
3.3.2.2 Kết quả định tính flavonoid
Hình 14 Định tính flavonoid với thuốc thử
(CH3COO)2Pb
1. Mẫu thử
2. Mẫu sau khi cho thuốc thử (CH3COO)2Pb vào Nhận xét: có xuất hiện tủa màu trắng
Hình 15 Định tính flavonoid với thuốc thử FeCl3
1. Mẫu thử
2. Mẫu sau khi cho thuốc thử thuốc thử FeCl3 Nhận xét: có xuất hiện kết tủa màu xanh lục
Hình 16 Định tính flavonoid với thuốc thử H2SO4
1. Mẫu thử
2. Định tính với thuốc thử H2SO4
Nhận xét: có xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ
3.3.3 Khảo sát sự hiện diện sterol 3.3.3.1 Thuốc thử sterol 3.3.3.1 Thuốc thử sterol
a. Thuốc thử Liebermann-Burchard
1 mL anhydrid acetic, 1 mL chloroform, làm lạnh, thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc.
Cho cao tổng vào ở dạng rắn hoặc pha trong chloroform.
Phản ứng dƣơng tính là dung dịch đổi thành màu xanh dƣơng, lục, cam hoặc đỏ,
màu này bền không đổi.
b. Thuốc thử Salkowski
Hòa tan 1-2 mg cao tổng ở dạng rắn trong 1 mL cloroform và nhỏ thêm vào 1 mL H2SO4 đậm đặc.
Phản ứng dƣơng tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh tím.
3.3.3.2 Kết quả định tính
Hình 17 Định tính sterol với thuốc thử
Liebermann-Burchard
1. Trƣớc khi cho mẫu cao tổng vào 2. Sau khi cho mẫu cao tổng vào
Nhận xét: có xuất hiện kết tủa màu xanh lục
Hình 18 Định tính sterol với thuốc thử Salkowski
1. Trƣớc khi cho mẫu cao tổng vào 2. Sau khi cho mẫu cao tổng vào Nhận xét: có xuất hiện kết tủa màu nâu
3.3.4 Khảo sát sự hiện diện của glycoside 3.3.4.1 Thuốc thử glycoside 3.3.4.1 Thuốc thử glycoside
a. Thuốc thử Molish
1% α-naphthol / 80% ethanol Hay dung dịch 5% blue thymol / 80% ethanol
Hay dung dịch 5% resorcinol / 80% ethanol.
Lấy dung dịch mẫu thử cho vào một ống nghiệm, thêm 1 mL H2SO4 đậm đặc, thêm 2-3 giọt dung dịch thuốc thử molish vào ống nghiệm một cách nhẹ nhàng sao cho không làm khuấy trộn hỗn hợp lên mà dung dịch này nằm thành một lớp trên mặt.
Nếu có glycoside (đƣờng aldose, cetose) sẽ xuất hiện ở mặt phân cách hai dung
dịch một vịng màu tím hay đỏ tùy loại thuốc thử.
b. Thuốc thử Felling A, B
Felling A: CuSO4
Felling B: Kali natri tartrat
Cho vào ống nghiệm vài giọt felling A, vài giọt felling B theo tỉ lệ 1:1, lắc, ta thấy xuất hiện màu xanh thẫm, thêm dung dịch mẫu thử rồi đem đun cách thủy.
Nếu có glycoside thì sau một thời gian đun sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch.
3.3.4.2 Kết quả định tính
Hình 19 Định tính glycoside với thuốc thử Molish
1. Trƣớc khi cho mẫu cao tổng vào 2. Sau khi cho mẫu cao tổng vào
Nhận xét: xuất hiện ở mặt phân cách hai dung
Hình 20 Định tính glycoside với thuốc thử Felling
1. Trƣớc khi đun cách thủy 2. Sau khi cho đun cách thủy
Nhận xét: sau một thời gian xuất hiện kết tủa
đỏ gạch.
Kết luận: trong cao tổng có sự hiện diện của glycoside.
3.3.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin 3.3.5.1 Thuốc thử saponin 3.3.5.1 Thuốc thử saponin
Ống nghiệm 1: 5 mL NaOH 0.1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Ống nghiệm 2: 5 mL HCl 0.1 N (pH=1) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Bịt miệng 2 ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống, để yên 15 phút và quan sát cột bọt trong 2 ống nghiệm. Nếu trong 2 ống nghiệm có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin.
3.3.5.2 Kết quả định tính
Hình 21 Định tính saponin Hình 22 Định tính saponin
Cột bọt trong hai ống nghiệm khi Cột bọt trong hai ống nghiệm vừa lắc xong. 15 phút sau khi lắc
Nhận xét: sau 15 phút cột bọt ở cả hai ống nghiệm đều khá bền. Kết luận: trong cao tổng có sự hiện diện của saponin.
3.3.6 Khảo sát sự hiện diện của tannin 3.3.6.1 Thuốc thử Stiasny 3.3.6.1 Thuốc thử Stiasny
20 mL formol 36 %, 10 mL HCl đậm đặc.
Phản ứng dƣơng tính có tannin khi xuất hiện kết tủa màu vàng nâu.
3.3.6.2 Kết quả định tính
Hình 23 Định tính tannin với thuốc thử Stiasny
1. Mẫu thử
2. Sau khi cho thuốc thử vào.
Nhận xét: xuất hiện kết tủa màu vàng nâu. Kết luận: trong cao tổng có sự hiện diện của tannin.
Bảng 1 Kết quả định tính cao ethanol tổng của vỏ Tràm
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tƣợng Kết luận
Alkaloid
Mayer Kết tủa màu vàng nhạt. có sự hiện diện của alkaloid Dragendorff Kết tủa màu nâu cam
Flavonoid
(CH3COO)2Pb Kết tủa màu trắng xanh
Có sự hiện diện của flavonoid Sắt (III) clorua
FeCl3 Kết tủa màu xanh lục
H2SO4 Kết tủa màu nâu đỏ
Sterol
Liebermann-
Burchard Kết tủa màu xanh lục Có sự hiện diện của Sterol
Salkowski Kết tủa màu nâu
Glycoside
Molish
Xuất hiện ở mặt phân cách hai dung dịch một vịng màu tím
Có sự hiện diện của glycosid
Felling Kết tủa đỏ gạch Saponin NaOH 0.1N,
HCl 0.1N Có cột bọt bền
Có sự hiện diện của saponin
Tannin
20 mL formol 36 %, 10 mL HCl đậm đặc
Kết tủa màu vàng nâu Có sự hiện diện của tannin
Kết luận: Trong vỏ Tràm có chứa đầy đủ 6 nhóm hợp chất hữu cơ, đó là: alkaloid,
3.4 Điều chế cao ethanol tổng (EtOH)
Từ 9 kg vỏ Tràm tƣơi xử lý thu đƣợc 3.8 kg vỏ Tràm khô. Lấy 1 kg xay nhỏ, cho vào các túi vải trắng, sau đó cho vào 3 lọ thủy tinh lớn, ngâm dầm với cồn 95 (V=20 lít)
Hình 24 Vỏ Tràm khơ xay Hình 25 Ngâm dầm với cồn 95
Sau 24 giờ, thu lấy dịch chiết, dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, dịch qua lọc đem cô quay thu hồi dung mơi thu đƣợc cao chiết ethanol tổng có màu vàng nâu. Q trình cứ lặp đi lặp lại đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Hình 26 Cao EtOH
Để xác định hiệu suất thu hồi cao EtOH so với lƣợng mẫu đem ngâm. Tôi tiến hành khảo sát lấy M =100 g mẫu vỏ Tràm đã xay nhỏ cho vào túi vải trắng, cho vào lọ thủy tinh nhỏ ngâm với ethanol, sau 24 giờ, thu dịch chiết, dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, dịch qua lọc đem cô quay thu hồi dung môi thu đƣợc cao chiết ethanol tổng có màu vàng nâu. Q trình cứ lặp đi lặp lại đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Thời gian thực hiện quá trình thu dịch chiết: 6 ngày
Khối lƣợng cao EtOH tổng thu đƣợc: 30.689 g
Hiệu suất thu hồi cao tổng:
30.698% 100% 100 30.689 100% M m (%) H caoPE EtOH
3.5 Điều chế cao petroleum ether (PE), cao ethyl acetate (Ea) và cao n-butanol và cao n-butanol
Từ khối lƣợng cao EtOH thu đƣợc, đem 30.698 g lắc chiết với PE bằng phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng, thu lấy dịch chiết PE, lọc, cô quay thu hồi dung môi, thu đƣợc cao PE có khối lƣợng là 11.128 g
Từ cao EtOH sau khi lắc chiết với PE, phần bã còn lại tiếp tục chiết lỏng lỏng với ethyl acetate, thu dịch chiết Ea, lọc, cô quay thu hồi dung mơi, thu đƣợc cao Ea có khối lƣợng là: 10.351 g.
Sau khi lắc chiết với Ea, phần bã còn lại tiếp tục lắc chiết với n-butanol, thu dịch chiết n-butanol, lọc, cô quay thu hồi dung mơi, thu đƣợc cao n-butanol, có khối lƣợng là: 5.708 g.
Hình 27 Dịch chiết các cao Hình 28 Chiết lỏng-lỏng Hình 29 Cao PE cao EtOH với PE
Bột vỏ Tràm (m = 100 g) Cao ethanol tổng (m = 30.698 g) Cao PE (m = 11.128 g) Bã Cao Ea (m = 10.351 g) Bã Cao n-butanol (m = 5.708 g) Bã (m = 3.527 g)
- Ngâm bột trong ethanol 95 - Cơ quay
- Trích với ete dầu hỏa - Cơ quay
- Trích với ethyl acetate - Cơ quay thu hồi dung mơi
- Trích với n-butanol - Cơ quay thu hồi dung mơi
TTíínnhh hhiiệệuu ssuuấấtt tthhuu hhồồii ccáácc ccaaoo::
% 594 . 18 100% 30.698 5.708 (%) H 30.719% 100% 30.698 10.351 (%) H 30.250% 100% 30.698 11.128 (%) H Butanol - Ea PE n TTíínnhh ttổnổngg hhiiệuệu ssuuấtất tthuhu hhồiồi ccáácc ccaaoo:: % 563 . 85 % 18.594 % 30.719 % 36.250 (%) H
Sơ đồ 3 Quy trình tách chiết và khối lƣợng các cao từ không phân cực đến phân cực
3.6 Khảo sát cao ethanol, cao PE, cao Ea, cao n-butannol bằng sắc ký bản mỏng (TLC) sắc ký bản mỏng (TLC)
Lấy dịch chiết các cao ethanol, cao PE, cao Ea, cao n-butannol. Tiến hành chấm bản mỏng với hệ dung mơi thích hợp cho sắc ký cột. Kết quả sắc ký bản mỏng sau:
Giải ly bản mỏng với các hệ dung môi petroleum ether-ethyl acetate (PE-Ea) có tỉ lệ khác nhau, nhúng bản mỏng vào thuốc thử hiện hình H2SO4 20 % trong methanol.
(1) (2) (3)
Hình 30 TLC các cao ethanol, cao PE, cao Ea, cao n-butanol
(1) Hệ giải ly PE:Ea = 7:3 (2) Hệ giải ly PE:Ea = 5:5 (3) Hệ giải ly Ea:Me = 9:1
Ghi chú: Vết chấm thứ 1 là dịch chiết cao tổng. vết thứ 2 lần lƣợt là dịch chiết cao PE, Ea, n-butanol
Nhận xét: Sau khi khảo sát TLC tôi quyết định khảo sát tiếp cao PE bằng sắc ký
cột pha thƣờng với hệ dung môi giải ly phù hợp nhất là PE:Ea = 7:3.
3.7 Khảo sát cao PE bằng sắc ký cột
3.7.1 Các thông số của cột sắc ký
- Khối lƣợng silica gel nạp cột: 30 g.
- Chiều cao lớp silica gel khi nạp vào cột: 22 cm.
- Khối lƣợng cao PE nạp cột: 3 g.
- Chiều cao lớp mẫu khi mới nạp vào cột: 0.5 cm.
Dung môi đƣợc chọn để hịa tan mẫu: PE.
Dung mơi đƣợc chọn làm dung mơi giải ly đầu tiên cho cột: PE.
Hình 31 Cột sắc ký cao PE 3.7.2 Theo dõi quá trình giải ly cột
Giải ly cột với dung môi tinh khiết, độ phân cực tăng dần từ PE 100% đến Ea.
Dung môi giải ly ra khỏi cột đƣợc hứng trong các lọ bi có thể tích là 20 mL, đƣợc đánh số thứ tự sẵn.
Sau đó chấm TLC các lọ này theo thứ tự đã đánh sẵn. Các vết chấm đƣợc so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng, từ đó gom chung các lọ có giá trị Rf giống nhau thành một phân đoạn.
Do thời gian từ lúc nạp mẫu đến lúc các chất bắt đầu giải ly ra khỏi cột khá nhanh, nên chúng tôi chọn dung môi giải ly bản mỏng đầu tiên là PE 100% với dung dịch thuốc thử hiện hình bản mỏng là: H2SO4 20% trong methanol.
Bảng 2 Kết quả Sắc ký cột cao PE Số thứ tự lọ phân đoạn Hệ dung môi giải ly cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Chất thu đƣợc Khảo sát TLC 1-20 I PE PE:Ea = 90:1 Chất lỏng sệt không màu 1 vết khá rõ
21-67 II PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 8:2 Hạt li ti không màu ở đáy lọ
2 vết khá rõ và phía trên, cịn
vài vết mờ
68-99 III PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 7:3
Tinh thể màu vàng ở đáy lọ, thành lọ có váng màu trắng trong 2 vết khá rõ
100-120 IV PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 7:3 Tinh thể màu trắng.
Một vết chính rất đậm và có những vết tạp.
121-157 V PE:Ea = 95:5 PE:Ea = 7:3 Hạt li ti màu
vàng nhạt Ba vết khá rõ
157-200 VI PE:Ea = 9:1 PE:Ea = 7:3 Hạt li ti không màu
Hai vết khá rõ và vài vết mờ
200-252 VII PE:Ea = 8:2 PE:Ea = 7:3 Chất rắn màu
trắng mịn Nhiều vết
Xả cột MeOH Chất rắn màu
Hình 32 TLC một vài phân đoạn
Sau khi sắc ký cột tôi thu đƣợc nhiều phân đoạn, trong đó phân đoạn IV là đáng chú ý nhất, do có khối lƣợng tƣơng đối lớn hơn và khi khảo sát bằng TLC thì cho thấy một vết khá rõ có lẫn vết tạp mờ. Tôi quyết định khảo sát phân đoạn IV trƣớc, các phân đoạn còn lại tạm để lại, sẽ khảo sát sau.
Hình 33 Lọ đựng tinh thể của phân đoạn IV
3.8 Khảo sát phân đoạn IV của cao PE
Căn cứ vào kết quả khảo sát bằng TLC, tôi tiến hành sắc ký cột làm sạch phân đoạn IV.
3.8.1 Các thông số của cột sắc ký
- Đƣờng kính cột sắc ký: 1 cm.
- Khối lƣợng silica gel: 8 g.
- Chiều cao silica gel khi nhồi vào cột: 18 cm.