1.3.1 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) còn gọi là sắc ký bản mỏng hay sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tƣợng hấp phụ. Trong đó, pha động là dung mơi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ trơ nhƣ: silica gel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kính, tấm nhơm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ đƣợc tráng thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này đƣợc gọi là sắc ký lớp mỏng (TLC).
1.3.1.1 Nguyên lý của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng
Trong sắc ký lớp mỏng có 4 cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử, nhƣng cơ chế hấp phụ chiếm phần lớn. Các chất cần tách trong TLC có thể khuếch tán theo cả chiều dọc và chiều ngang đối với phƣơng chuyển động của dung môi. Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong
quá trình di chuyển mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại những vị trí khác nhau.
1.3.1.2 Chất hấp phụ
a. Hiện tƣợng hấp phụ
Hiện tƣợng hấp phụ là sự tích tụ một chất ở thể khí hoặc trong dung dịch trên bề mặt một chất rắn. Hiện tƣợng này xảy ra trên bề mặt, do đó độ mịn của chất hấp phụ có tầm quan trọng ảnh hƣởng đến mức độ phân tách sắc ký hấp phụ.
b. Chất hấp phụ
Các chất hấp phụ đƣợc dùng trong sắc ký lớp mỏng hầu hết là các oxit không tan, các oxit hydrate hóa và các muối.
Một số chất hấp phụ đƣợc dùng nhƣ: saccharose, Na2CO3, CaCO3, MgCO3,
MgO, … Trong phân tích dƣợc liệu, chất hấp phụ thông dụng nhất là silica gel và nhôm oxit.
1.3.1.3 Chấm chất phân tích
Cho mẫu phân tích vào một dung mơi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm chất này thành một vết nhỏ, gọn lên tấm bảng mỏng.
Yêu cầu đối với vết chấm:
Vết chấm phải nhỏ và đều nhau.
Lƣợng chất phải đồng đều nhau giữa các vết chấm.
Khoảng cách giữa các vết chấm đều nhau. Để đạt đƣợc các yêu cầu trên thì ta phải:
Hịa tan chất thử vào dung mơi dễ bay hơi.
Dịch chấm có nồng độ vừa phải, khơng lỗng q hay đặc quá.
Que chấm (ống mao quản) bé và đều nhau.
Nếu có điều kiện thì đặt tấm bảng mỏng lên trên một mặt phẳng kim loại nóng để bốc hơi nhanh dung mơi hoặc dùng máy sấy tóc để hơ nóng vết chấm sau mỗi lần chấm, nếu khơng thì ta dùng miệng để thổi cho dung mơi bay hơi nhanh hơn.
Sau khi chấm hoàn tất, nhúng bản mỏng vào dung môi giải ly đƣợc đặt trong bình kín.
1.3.1.4 Giải ly bản mỏng
a. Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình có kích thƣớc lớn hơn một chút so với kích thƣớc của bản mỏng. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì nhƣ thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất. Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung mơi vào bình, với sắc ký lớp mỏng định tính, chỉ cần một thể tích khoảng 10 mL dung mơi. Chiều cao của lớp dung mơi trong bình khơng đƣợc cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bảng mỏng (vết chấm trên bảng mỏng không đƣợc ngập vào trong dung mơi khi vừa mới thả bản vào bình).
Bình triển khai bản mỏng yêu cầu phải:
Kín
Đáy bằng và khơng rộng lắm.
Có giấy lọc dùng bảo hịa dung mơi trong bình.
Cho dung mơi bảo hịa bình một thời gian trƣớc khi đặt bản mỏng vào.
Trong quá trình giải ly khơng di chuyển bình, đặt bình vào nơi kín gió.
Đong dung mơi đúng tỉ lệ đã định và trộn thật đều trƣớc khi rót vào bình.
Hình 7 Giải ly bản mỏng
b. Các kỹ thuật giải ly bản mỏng
Sau khi bình đã bảo hịa dung mơi, ngƣời ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở phía trên cao, gần với nắp đậy bình. Ở phía trên cao của bình triển khai, có một máng nhỏ chứa dung mơi giải ly. Ngƣời ta cho một tờ giấy lọc (có chiều ngang bằng chiều ngang của tấm bảng mỏng) vắt ngang từ máng qua tấm lớp mỏng, để dung môi từ máng di chuyển đến cạnh đầu trên của tấm lớp mỏng rồi đi xuống dƣới thấp.
Dung môi giải ly di chuyển lên
Sau khi bình đã bảo hịa dung mơi, ngƣời ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dƣới gần đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0.5-1 cm.
Giải ly nhiều lần liên tiếp
Kỹ thuật đƣợc áp dụng để tách mẫu có chứa các hợp chất có Rf gần sát nhau, thực hiện bằng cách giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đã chọn. Mỗi lần giải ly xong, lấy bản ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa.
Giải ly hai chiều
Trên tấm sắc ký bản mỏng hình vng, thí dụ 2020 cm, chấm dung dịch mẫu cần phân tích lên góc phải, cách hai bìa một khoảng 2-3 cm, giải ly với hệ dung môi X. Lấy bản ra, sấy khô và xoay bản 90, đặt trở lại bình sắc ký để đƣợc giải ly với hệ dung mơi Y.
1.3.1.5 Hiện hình các vết sau khi giải ly
Sau khi giải ly xong, các vết có màu sẽ đƣợc phát hiện bằng mắt thƣờng, nhƣng phần lớn các hợp chất hữu cơ khơng có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phƣơng pháp hóa học hoặc vật lý.
a. Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp thông dụng nhất là phát hiện bằng tia tử ngoại (UV). Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sát bản mỏng bằng tia UV, dụng cụ này có gắn hai bóng đèn UV với hai loại bƣớc sóng là 254 nm và 366 nm.
Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV. Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm. Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng
này dùng để phát hiện hợp chất có phát huỳnh quang. Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu.
b. Phƣơng pháp hóa học
Phƣơng pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hịa thuốc thử vào một dung mơi thích hợp rồi phun xịt thuốc thử này lên bản mỏng hoặc nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử.
Các thuốc thử đƣợc xếp thành hai loại:
Thuốc thử khơng đặc trƣng: khi nó tạo vết có màu với hầu hết các loại hợp chất hữu cơ, thí dụ: iodo, sulfuric acid, chất chỉ thị phát huỳnh quang, …
Thuốc thử đặc trƣng: chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa những nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trƣng, thí dụ: thuốc thử dinitrophenylhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonyl tạo màu đỏ đậm.
1.3.1.6 Các công dụng của sắc ký lớp mỏng
Kỹ thuật TLC hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên:
Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập đƣợc.
Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay khơng.
Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát.
Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột.
Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ.
Để kiểm tra biết một hợp chất có kém bền.
Để cô lập hợp chất (sắc ký lớp mỏng điều chế).