3.3 Định tính sơ bộ cao tổng
3.3.6 Khảo sát sự hiện diện của tannin
3.3.6.1 Thuốc thử Stiasny
20 mL formol 36 %, 10 mL HCl đậm đặc.
Phản ứng dƣơng tính có tannin khi xuất hiện kết tủa màu vàng nâu.
3.3.6.2 Kết quả định tính
Hình 23 Định tính tannin với thuốc thử Stiasny
1. Mẫu thử
2. Sau khi cho thuốc thử vào.
Nhận xét: xuất hiện kết tủa màu vàng nâu. Kết luận: trong cao tổng có sự hiện diện của tannin.
Bảng 1 Kết quả định tính cao ethanol tổng của vỏ Tràm
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tƣợng Kết luận
Alkaloid
Mayer Kết tủa màu vàng nhạt. có sự hiện diện của alkaloid Dragendorff Kết tủa màu nâu cam
Flavonoid
(CH3COO)2Pb Kết tủa màu trắng xanh
Có sự hiện diện của flavonoid Sắt (III) clorua
FeCl3 Kết tủa màu xanh lục
H2SO4 Kết tủa màu nâu đỏ
Sterol
Liebermann-
Burchard Kết tủa màu xanh lục Có sự hiện diện của Sterol
Salkowski Kết tủa màu nâu
Glycoside
Molish
Xuất hiện ở mặt phân cách hai dung dịch một vịng màu tím
Có sự hiện diện của glycosid
Felling Kết tủa đỏ gạch Saponin NaOH 0.1N,
HCl 0.1N Có cột bọt bền
Có sự hiện diện của saponin
Tannin
20 mL formol 36 %, 10 mL HCl đậm đặc
Kết tủa màu vàng nâu Có sự hiện diện của tannin
Kết luận: Trong vỏ Tràm có chứa đầy đủ 6 nhóm hợp chất hữu cơ, đó là: alkaloid,
3.4 Điều chế cao ethanol tổng (EtOH)
Từ 9 kg vỏ Tràm tƣơi xử lý thu đƣợc 3.8 kg vỏ Tràm khô. Lấy 1 kg xay nhỏ, cho vào các túi vải trắng, sau đó cho vào 3 lọ thủy tinh lớn, ngâm dầm với cồn 95 (V=20 lít)
Hình 24 Vỏ Tràm khơ xay Hình 25 Ngâm dầm với cồn 95
Sau 24 giờ, thu lấy dịch chiết, dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, dịch qua lọc đem cô quay thu hồi dung mơi thu đƣợc cao chiết ethanol tổng có màu vàng nâu. Quá trình cứ lặp đi lặp lại đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Hình 26 Cao EtOH
Để xác định hiệu suất thu hồi cao EtOH so với lƣợng mẫu đem ngâm. Tôi tiến hành khảo sát lấy M =100 g mẫu vỏ Tràm đã xay nhỏ cho vào túi vải trắng, cho vào lọ thủy tinh nhỏ ngâm với ethanol, sau 24 giờ, thu dịch chiết, dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, dịch qua lọc đem cô quay thu hồi dung mơi thu đƣợc cao chiết ethanol tổng có màu vàng nâu. Q trình cứ lặp đi lặp lại đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Thời gian thực hiện quá trình thu dịch chiết: 6 ngày
Khối lƣợng cao EtOH tổng thu đƣợc: 30.689 g
Hiệu suất thu hồi cao tổng:
30.698% 100% 100 30.689 100% M m (%) H caoPE EtOH
3.5 Điều chế cao petroleum ether (PE), cao ethyl acetate (Ea) và cao n-butanol và cao n-butanol
Từ khối lƣợng cao EtOH thu đƣợc, đem 30.698 g lắc chiết với PE bằng phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng, thu lấy dịch chiết PE, lọc, cô quay thu hồi dung mơi, thu đƣợc cao PE có khối lƣợng là 11.128 g
Từ cao EtOH sau khi lắc chiết với PE, phần bã còn lại tiếp tục chiết lỏng lỏng với ethyl acetate, thu dịch chiết Ea, lọc, cô quay thu hồi dung mơi, thu đƣợc cao Ea có khối lƣợng là: 10.351 g.
Sau khi lắc chiết với Ea, phần bã còn lại tiếp tục lắc chiết với n-butanol, thu dịch chiết n-butanol, lọc, cô quay thu hồi dung mơi, thu đƣợc cao n-butanol, có khối lƣợng là: 5.708 g.
Hình 27 Dịch chiết các cao Hình 28 Chiết lỏng-lỏng Hình 29 Cao PE cao EtOH với PE
Bột vỏ Tràm (m = 100 g) Cao ethanol tổng (m = 30.698 g) Cao PE (m = 11.128 g) Bã Cao Ea (m = 10.351 g) Bã Cao n-butanol (m = 5.708 g) Bã (m = 3.527 g)
- Ngâm bột trong ethanol 95 - Cơ quay
- Trích với ete dầu hỏa - Cơ quay
- Trích với ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung mơi
- Trích với n-butanol - Cơ quay thu hồi dung mơi
TTíínnhh hhiiệệuu ssuuấấtt tthhuu hhồồii ccáácc ccaaoo::
% 594 . 18 100% 30.698 5.708 (%) H 30.719% 100% 30.698 10.351 (%) H 30.250% 100% 30.698 11.128 (%) H Butanol - Ea PE n TTíínnhh ttổnổngg hhiiệuệu ssuuấtất tthuhu hhồiồi ccáácc ccaaoo:: % 563 . 85 % 18.594 % 30.719 % 36.250 (%) H
Sơ đồ 3 Quy trình tách chiết và khối lƣợng các cao từ khơng phân cực đến phân cực
3.6 Khảo sát cao ethanol, cao PE, cao Ea, cao n-butannol bằng sắc ký bản mỏng (TLC) sắc ký bản mỏng (TLC)
Lấy dịch chiết các cao ethanol, cao PE, cao Ea, cao n-butannol. Tiến hành chấm bản mỏng với hệ dung mơi thích hợp cho sắc ký cột. Kết quả sắc ký bản mỏng sau:
Giải ly bản mỏng với các hệ dung môi petroleum ether-ethyl acetate (PE-Ea) có tỉ lệ khác nhau, nhúng bản mỏng vào thuốc thử hiện hình H2SO4 20 % trong methanol.
(1) (2) (3)
Hình 30 TLC các cao ethanol, cao PE, cao Ea, cao n-butanol
(1) Hệ giải ly PE:Ea = 7:3 (2) Hệ giải ly PE:Ea = 5:5 (3) Hệ giải ly Ea:Me = 9:1
Ghi chú: Vết chấm thứ 1 là dịch chiết cao tổng. vết thứ 2 lần lƣợt là dịch chiết cao PE, Ea, n-butanol
Nhận xét: Sau khi khảo sát TLC tôi quyết định khảo sát tiếp cao PE bằng sắc ký
cột pha thƣờng với hệ dung môi giải ly phù hợp nhất là PE:Ea = 7:3.
3.7 Khảo sát cao PE bằng sắc ký cột
3.7.1 Các thông số của cột sắc ký
- Khối lƣợng silica gel nạp cột: 30 g.
- Chiều cao lớp silica gel khi nạp vào cột: 22 cm.
- Khối lƣợng cao PE nạp cột: 3 g.
- Chiều cao lớp mẫu khi mới nạp vào cột: 0.5 cm.
Dung mơi đƣợc chọn để hịa tan mẫu: PE.
Dung mơi đƣợc chọn làm dung môi giải ly đầu tiên cho cột: PE.
Hình 31 Cột sắc ký cao PE 3.7.2 Theo dõi quá trình giải ly cột
Giải ly cột với dung môi tinh khiết, độ phân cực tăng dần từ PE 100% đến Ea.
Dung môi giải ly ra khỏi cột đƣợc hứng trong các lọ bi có thể tích là 20 mL, đƣợc đánh số thứ tự sẵn.
Sau đó chấm TLC các lọ này theo thứ tự đã đánh sẵn. Các vết chấm đƣợc so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng, từ đó gom chung các lọ có giá trị Rf giống nhau thành một phân đoạn.
Do thời gian từ lúc nạp mẫu đến lúc các chất bắt đầu giải ly ra khỏi cột khá nhanh, nên chúng tôi chọn dung môi giải ly bản mỏng đầu tiên là PE 100% với dung dịch thuốc thử hiện hình bản mỏng là: H2SO4 20% trong methanol.
Bảng 2 Kết quả Sắc ký cột cao PE Số thứ tự lọ phân đoạn Hệ dung môi giải ly cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Chất thu đƣợc Khảo sát TLC 1-20 I PE PE:Ea = 90:1 Chất lỏng sệt không màu 1 vết khá rõ
21-67 II PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 8:2 Hạt li ti không màu ở đáy lọ
2 vết khá rõ và phía trên, cịn
vài vết mờ
68-99 III PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 7:3
Tinh thể màu vàng ở đáy lọ, thành lọ có váng màu trắng trong 2 vết khá rõ
100-120 IV PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 7:3 Tinh thể màu trắng.
Một vết chính rất đậm và có những vết tạp.
121-157 V PE:Ea = 95:5 PE:Ea = 7:3 Hạt li ti màu
vàng nhạt Ba vết khá rõ
157-200 VI PE:Ea = 9:1 PE:Ea = 7:3 Hạt li ti không màu
Hai vết khá rõ và vài vết mờ
200-252 VII PE:Ea = 8:2 PE:Ea = 7:3 Chất rắn màu
trắng mịn Nhiều vết
Xả cột MeOH Chất rắn màu
Hình 32 TLC một vài phân đoạn
Sau khi sắc ký cột tơi thu đƣợc nhiều phân đoạn, trong đó phân đoạn IV là đáng chú ý nhất, do có khối lƣợng tƣơng đối lớn hơn và khi khảo sát bằng TLC thì cho thấy một vết khá rõ có lẫn vết tạp mờ. Tôi quyết định khảo sát phân đoạn IV trƣớc, các phân đoạn còn lại tạm để lại, sẽ khảo sát sau.
Hình 33 Lọ đựng tinh thể của phân đoạn IV
3.8 Khảo sát phân đoạn IV của cao PE
Căn cứ vào kết quả khảo sát bằng TLC, tôi tiến hành sắc ký cột làm sạch phân đoạn IV.
3.8.1 Các thông số của cột sắc ký
- Đƣờng kính cột sắc ký: 1 cm.
- Khối lƣợng silica gel: 8 g.
- Chiều cao silica gel khi nhồi vào cột: 18 cm.
- Khối lƣợng mẫu nạp cột: 0.105 g
Dung môi đƣợc chọn làm dung môi giải ly đầu tiên cho cột: PE.
Hình 34 Cột sắc ký phân đoạn IV 3.8.2 Theo dõi quá trình giải ly cột
Theo dõi tiến trình giải ly cột thì các chất tạp sẽ ra trƣớc, kế tiếp là vết chính và sau đó là các chất tạp. Nên tơi chọn hệ dung môi giải ly cột đầu tiên là PE 100%, sau đó sẽ tăng độ phân cực của dung môi giải ly cột, nhƣng tăng rất chậm.
Dung môi giải ly ra khỏi cột đƣợc hứng trong các lọ bi có thể tích là 10 mL, đƣợc đánh số thứ tự sẵn.
Sau đó chấm TLC các lọ này theo thứ tự đã đánh sẵn. Các vết chấm đƣợc so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá trị Rf đƣợc dễ dàng hơn. Các bản mỏng đƣợc nhúng trong dung dịch thuốc hiện hình là H2SO4 20% trong MeOH.
Bảng 3 kết quả sắc ký cột phân đoạn IV Số thứ tự lọ Hệ dung môi giải ly cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Khảo sát TLC Ghi chú
1-36 PE PE:Ea = 7:3 Không hiện vết
36-52 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 7:3 Không hiện vết 53-76 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 7:3 Xuất hiện vết mờ
76-98 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 7:3 Xuất hiện một vết khá rõ Khối lƣợng ít nên khơng gủi phổ. (Đặt tên là TRANG02)
99-110 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 7:3 Không xuất hiện vết
111-137 PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 7:3 Vết chính bắt đầu xuất hiện nhƣng mờ 138-165 PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 7:3 Vết chính xuất hiện khá rõ nhƣng còn lẫn vết dơ ở trên 165-186 PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 7:3 Vết chính xuất hiện khá trịn khơng cịn vết dơ Gửi đo phổ (đặt tên là TRANG01) 187-210 PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 7:3 Vết chính xuất hiện nhƣng cịn vết dơ ở dƣới Xả cột MeOH
Một số kết quả TLC ở giai đoạn này
Hình 35 Kết quả TLC phân đoạn IV
Hệ giải ly PE:Ea = 7:3
3.8.3 Khảo sát chất vừa mới cô lập đƣợc 3.8.3.1 Chất đặt tên TRANG01 3.8.3.1 Chất đặt tên TRANG01
Hình 36 Lọ đựng mẫu gửi đi đo phổ của chất TRANG01
(1) (2) (3)
Hình 37 TLC khảo sát hợp chất vừa cơ lập TRANG01
(1) Hệ Dichlorommethane 100% (2) Hệ PE:Ea = 7:3
(3) Hệ PE:Ea = 5:5
Nhận xét: Kết quả TLC cho thấy, với 3 hệ dung môi khác nhau mẫu đều cho 1
vết rõ, khơng có hiện một vết nào khác. Điều này chứng tỏ mẫu chất tôi thu đƣợc gần nhƣ tinh khiết.
Một vài đặc điểm của chất vừa cô lập đƣợc:
Màu: tinh thể màu trắng.
Hoạt tính UV: sau khi giải ly bản mỏng, soi bản mỏng dƣới đèn UV không thấy phát huỳnh quang, vậy chất vừa cơ lập khơng có hoạt tính UV.
Kết quả phổ 1
H-NMR của chất TRANG01
Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3, (ppm), J (Hz)) phổ đồ trình bày trong phụ
lục 1.
Khảo sát phổ 1
H NMR của chất TRANG01 cho ta các dữ liệu sau:
ppmcó 7 mũi cao và gần nhau nên có thể chất TRANG01 là một
petacyclic triterpenoid.
m, H-3), s, Hα-29), s, H-29) và nhiều peak khác gồm cả những peak tạp.
Dựa vào dữ liệu trên và kết hợp với phổ chuẩn của lupeol, tơi dự đốn chất vừa cô lập đƣợc TRANG01 là dẫn xuất lupeol
Kết luận: chất vừa cô lập đƣợc TRANG01 là dẫn xuất lupeol. 3.8.3.2 Chất đặt tên TRANG02
Hình 38 Lọ đựng hợp chất vừa cơ lập TRANG02
(1) (2) (3)
Hình 39 TLC khảo sát hợp chất vừa cô lập TRANG02
(1) Hệ dung môi giải ly PE 100% (2) Hệ dung môi giải ly PE:Ea = 7:3 (3) Hệ dung môi giải ly Dichloromethane
3.9 Tiến hành kết tinh phân đoạn cao PE và tiến hành sắc ký cột. cột.
Nhận thấy chất tôi vừa cơ lập đƣợc tan tốt trong Ea và ít tan trong PE nên tôi tiến hành kết tinh phân đoạn cao PE
3.9.1 Quy trình kết tinh cao PE
Chuẩn bị: 2 cốc thủy tinh 100 ml sạch
Cốc thứ 1: chứa 1g cao PE khô cho vào 10 ml Ea. Cốc thứ 2: chứa 80 ml PE.
Dùng pasteur pipet hút dung dịch cốc thứ 1 cho vào cốc thứ 2 một cách từ từ. Tiến hành lọc tôi thu đƣợc chất kết tinh có màu trắng (đặt tên KT).
3.9.2 Khảo sát TLC chất màu trắng KT
Hình 41 TLC của chất màu trắng KT
Hệ giải ly PE:Ea = 7:3
Kết luận: dựa vào kết quả TLC tôi quyết định tiến hành sắc ký cột chất màu trắng. 3.9.3 Sắc ký cột chất màu trắng (KT)
Các thông số của cột sắc ký
- Đƣờng kính cột sắc ký: 1 cm.
- Khối lƣợng silica gel: 6 g.
- Chiều cao silica gel khi nhồi vào cột: 18 cm.
- Khối lƣợng mẫu nạp cột: 0.071 g
Hình 42 Cột sắc ký chất màu trắng (KT) Bảng 4 Kết quả sắc ký cột chất màu trắng KT Số thứ tự lọ Hệ dung môi giải ly cột Hệ dung môi giải ly bản mỏng Khảo sát TLC Ghi chú
1-20 PE PE:Ea = 7:3 Không hiện vết
20-52 PE:Ea = 99:1 PE:Ea = 7:3 Không hiện vết 53-72 PE:Ea = 98:2 PE:Ea = 7:3 Xuất hiện vết mờ
73-99 PE:Ea = 97:3 PE:Ea = 7:3
Xuất hiện 1 vết khá rõ nhƣng còn dơ ở phía trên và phía dƣới
Tinh thể màu trắng (TRANG03)
73-99 PE:Ea = 95:5 PE:Ea = 7:3 Xuất hiện nhiều vết Xả cột MeOH
Hình 43 Lọ đựng chất TRANG03 (1) (2) (3) Hình 44 TLC khảo sát chất TRANG03
(1) Hệ dung môi giải ly PE:Ea = 7:3 (2) Hệ dung môi giải ly Dichloromethane (3) Hệ dung môi giải ly PE:Ea = 5:5
Kết luận: Khảo sát TLC cho thấy chất TRANG03 vừa cô lập khơng tinh khiết.
Mặt khác, do chất Trang03 ít nên tôi không thể sắc ký cột tiếp để làm sạch và cũng sắp tới thời gian báo cáo.
Chƣơng 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
Qua quá trình thực hiện đề tài, tơi đã đạt đƣợc một số kết quả sau:
Xác định độ ẩm của mẫu vỏ Tràm - Melaleuca cajuputi Powell xay nhỏ là 8.819%.
Định tính sự hiện diện của các hợp chất hữu cơ trong cao EtOH tổng và xác định đƣợc có sự hiện diện của 6 nhóm hợp chất: alkaloid, sterol, glycoside, flavonoid, saponin, tannin.
Điều chế các cao gồm: cao EtOH tổng, cao PE, cao Ea, cao n-butanol. Xác định khối lƣợng các cao và tính hiệu suất thu cao.
Sắc ký cột cao PE thu đƣợc nhiều phân đoạn, tôi tiến hành khảo sát phân đoạn IV thu đƣợc một chất gửi đo phổ và một chất có khối lƣợng ít nên khơng gửi đo phổ.
Qua kết quả phổ có thể dự đốn cấu trúc chất cơ lập đƣợc TRANG01 là dẫn xuất lupeol.
Tiến hành kết tinh phân đoạn cao PE và tiến hành sắc ký cột nhƣng không cô lập đƣợc chất tinh khiết.
4.2 Kiến nghị
Do thực hiện đề tài trong thời gian tƣơng đối ngắn, nên tôi chỉ khảo sát trên cao PE của vỏ Tràm - Melaleuca cajuputi Powell, chƣa nghiên cứu sâu hơn về các cao
khác nhƣ ethylacetate, buthanol, … Hy vọng rằng trong thời gian tới sẽ có những nghiên cứu tiếp theo sâu hơn về vỏ cây Tràm - Melaleuca cajuputi Powell để góp