4. Tính mới của đề tài
2.2.8 Phƣơng pháp đánh giá an toàn của chế phẩm bảo quản chứa tinh dầu nghệ
Thử nghiệm độc tính bán cấp của chế phẩm đƣợc tiến hành tại Khoa Dƣợc lý, Viện kiểm nghiệm thuốc TW, 48 Hai Bà Trƣng, Hà Nội theo phƣơng pháp Abraham, quy định của tổ chức y tế thế giới và Bộ Y Tế về hiệu lực an toàn thuốc 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 [27,138].
Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng giống Swiss, cân nặng 18-20g/con, số lƣợng 40 con đƣợc chia thành các lô thí nghiệm, mỗi lô 10 con do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
Điều kiện chăm sóc: động vật thí nghiệm đƣợc nuôi trong điều kiện chuồng thoáng mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột. Tất cả động vật thí nghiệm đƣợc để ổn định trƣớc khi tiến hành thử nghiệm và theo dõi cân nặng trong quá trình thử nghiệm.
Chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng trong bảo quản cam - BQC đƣợc dùng nguyên trạng, không pha loãng. Các mức liều thử nghiệm:
- Mức liều 1: 20 ml mẫu thử/kg chuột x 1 lần uống/ngày - Mức liều 2: 20 ml mẫu thử/kg chuột x 2 lần uống/ngày - Mức liều 3: 20 ml mẫu thử/kg chuột x 3 lần uống/ngày Mỗi lần uống cách nhau 2 giờ
Các bƣớc tiến hành
- Chuột đƣợc nhịn ăn 15 giờ trƣớc khi thí nghiệm, nƣớc uống theo nhu cầu. Kiểm tra cân nặng trƣớc khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng đƣợc đƣa đi thử nghiệm.
- Cách dùng: đƣa mẫu thử dƣới dạng hỗn dịch theo đƣờng uống. Lấy thể tích mẫu thử theo qui định đƣa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù. Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 40 chuột, chia thành 4 nhóm gồm nhóm đối chứng dùng nƣớc cất và ba nhóm thử theo mức liều đã dự định. Các nhóm thử đƣợc dùng hỗn dịch thử ở các mức liều và số lần đƣa mẫu thử nhƣ bảng 2.8.
Bảng 2. 8: Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp của các mẫu BQC
Nhóm chuột Liều dùng (ml mẫu/20g chuột) Liều dùng (ml mẫu/kg chuột) Số chuột Thí nghiệm Nhóm chứng 0,4 ml nƣớc cất x 3 lần - 10
Mức liều 1 0,4 ml mẫu thử x 1 lần 20 ml mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 2 0,4 ml mẫu thử x 2 lần 40 ml mẫu thử/kg chuột 10 Mức liều 3 0,4 ml mẫu thử x 3 lần 60 ml mẫu thử/kg chuột 10
Lịch theo dõi: theo dõi biểu hiện của chuột ngay sau khi uống, trong 24 giờ đầu và theo dõi hoạt động của động vật thí nghiệm trong thời gian 7 ngày. Cân trọng lƣợng chuột trƣớc và sau khi uống 7 ngày.
2.2.9 ức chế sinh trƣởng nấm da với tinh dầu nghệ vàng
- Lấy 500µl m gây bệnh trên da
eppendorf trộn đều với 100µl tinh dầu có nồng độ ức chế tối thiểu
60’, te ừ khuẩn lạc phát triển
2.2.10 Phƣơng pháp đánh giá các chỉ tiêu cảm quan, hóa lí của chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng da có chứa tinh dầu nghệ vàng
a. Xác định pH: Để đảm bảo sản phẩm đến tay ngƣời tiêu dùng an toàn thì pH đạt 6,5-7 và đo bằng máy đo pH do độ nhớt của dung dịch cao nên khó thực hiện bằng các chỉ thị màu
b. Xác định khả năng chịu nhiệt: Duy trì chế phẩm ở nhiệt độ 40oC trong 24h, sau đó để ở nhiệt độ phòng đến khi sản phẩm trở lại trạng thái ban đầu
c. Xác định khả năng chịu lạnh: Duy trì chế phẩm ở nhiệt độ -5oC -0 oC trong 24h, sau đó để ở nhiệt độ phòng kiểm tra vẫn không bị tách nƣớc
d. Đánh giá cảm quan:
- Trạng thái: Hệ nhũ tƣơng đồng nhất, mịn mặt, không có tạp chất lạ - Màu sắc: Có màu trắng, đồng đều
- Mùi: Thơm dễ chịu, thoang thoảng mùi nghệ
- Ngoại quan: không có vật bất thƣờng, tốc độ lan nhanh và khô trên da
2.2.11 Phƣơng pháp đánh giá độ kích ứng da của chế phẩm chăm sóc da
Thử kích ứng trên da là một phƣơng pháp sinh học dựa vào mức độ phản ứng của da thỏ với chất thử so với phần da kế bên không đắp chất thử (tiêu chuẩn độ kích ứng da và phƣơng pháp thử của Bộ Y Tế áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm và ban hành kèm theo Quyết định số 3113/1999/QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ trƣởng Bộ Y tế. Tiêu chuẩn này cũng phù hợp với ISO 10993-10).
Cách tiến hành
Động vật thí nghiệm: Thỏ khỏe mạnh, không phân biệt giống, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm trọng lƣợng 1,8-2,2kg. Trƣớc khi thí nghiệm theo dõi từ 4-5 ngày đều nuôi dƣỡng ở nhiệt độ phòng, thức ăn tổng hợp, nƣớc uống tự do, nhanh nhẹn, lông mƣợt, không có bệnh ngoài da và đƣờng tiêu hóa.
Thử nghiệm đƣợc tiến hành trên 6 thỏ.
Dùng dao cạo sạch lông thỏ từ giữa lƣng sang hai bên khoảng 10cm, sát trùng bằng cồn 70% trƣớc khi đặt mẫu thử. Trên mỗi thỏ, mỗi bên tại vùng da lƣng đã cạo đặt một điểm chất thử với liều 0,5g. Trong nghiên cứu này, đặt bên phải là thuốc kem chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu.
Đặt mẫu thử đã chuẩn bị ở trên lên miếng gạc không gây kích ứng 2,5 cm x 2,5 cm. Cố định miếng gạc bằng băng dính không gây kích ứng ít nhất trong 4 giờ. Sau đó bỏ gạc và băng dính, chất thử còn lại đƣợc làm sạch bằng dung môi thích hợp không gây kích ứng.
Quan sát và ghi điểm
Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt chất thử so với da kề bên không đặt chất thử ở các thời điểm 4 giờ, 24 giờ , 48 giờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử.
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo qui định
Bảng 2. 9: Mức độ phản ứng trên da thỏ
Phản ứng Điểm đánh giá
Sự tạo vẩy và ban đỏ
- Không ban đỏ
- Ban đỏ rất nhẹ(vừa đủ nhận thấy) - Ban đỏ nhận thấy rõ
- Ban đỏ vừa phải đến nặng
Ban đỏ nghiêm trọng (đỏ tấy) đến tạo thành vẩy dể ngăn ngừa sự tiến triển của ban đỏ
0 1 2 3 4 Gây phù nề - Không phù nề - Phù nề rất nhẹ (vừa đủ nhận thấy)
- Phù nề nhận thấy rõ (viền phù nề phồng lên rõ) - Phù nề vừa phải (da phồng lên khoảng 1 mm)
- Phù nề nghiêm trọng (da phồng lên trên 1 mm và có lan rộng ra vùng xung quanh) 0 1 2 3 4
Tổng số điểm kích ứng tối đa có thể 8
Những thay đổi khác trên da cần theo dõi và ghi chép đầy đủ. Đánh giá kết quả
Trên mỗi thỏ, điểm phản ứng đƣợc tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử đƣợc lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử.
Đối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui định để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.
Bảng 2. 10: Phân loại các phản ứng trên da thỏ
Loại phản ứng Điểm trung bình
Kích ứng không đáng kể 0-0,4
Kích ứng nhẹ 0,5-1,9
Kích ứng vừa phải 2,0 – 4,9 Kích ứng nghiêm trọng 5,0 – 8,0
2.2.12 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm đƣợc xác định bằng phân tích phƣơng sai ANOVA với sự hỗ trợ của phần mềm R. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại mỗi công thức thí nghiệm.
Trong thí nghiệm xây dựng quy trình sử dụng chế phẩm bảo quản chứa tinh dầu nghệ vàng các thí nghiệm đƣợc bố trí theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken, với nhân kế hoạch k
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát phƣơng pháp thu nhận tinh dầu nghệ vàng
3.1.1 Hiệu quả thu nhận tinh dầu nghệ vàng bằng các phƣơng pháp khác nhau.
Nghệ tƣơi đƣợc thu hoạch sau 9 tháng ở huyện Khoái Châu, tỉnh Hƣng Yên. Củ nghệ gồm có các củ cái và củ nhánh (còn gọi là củ ngón). Các củ cái có màu vàng sẫm hơn một chút nhƣng có nhiều chất xơ, nhựa sáp hơn và vỏ dầy. Các củ ngón khi cây đủ già có màu sắc gần tƣơng đƣơng với củ cái nhƣng có vỏ mỏng hơn nhiều.Trong đề tài, chúng tôi tập trung vào tách chiết tinh dầu nghệ từ các củ ngón có độ ẩm trung bình 83% xác định bằng phƣơng pháp chƣng cất với toluene. Có thể đánh giá cảm quan chất lƣợng củ nghệ thông qua màu sắc của nó khi bẻ ra. Củ vàng sẫm từ trong ra ngoài là dùng đƣợc. Tiến hành làm nhỏ nguyên liệu kích thƣớc khoảng 4 mm để tăng khả năng tiếp xúc với dung môi, tạo điều kiện cho quá trình trích ly và chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc. Bằng phƣơng pháp tách chiết bằng dung môi kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1
Bảng 3. 1: So sánh hàm lượng tách chiết dung môi
Dung môi Dich chiết thô (%) Sáp nhựa (%) Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng tƣơi (%) Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng khô (%) n-hexane 0,80 0,025 0,07 0,01 0,63 0,01 3,2 0,01 Chloroform 0,70 0,029 0,1 0,01 0,58 0,02 2,8 0,02
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n=3
Tinh dầu nghệ vàng tan trong các dung môi không phân cực nên chúng tôi lựa chọn dung môi n-hexane và chloroform. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, hàm lƣợng tinh dầu thu đƣơc khi tách chiết bằng n-hexan cao hơn so với dung môi chloroform, đây cũng là dung môi đƣợc sử dụng phổ biến để tách các loại tinh dầu. Nhƣ vậy, hiệu suất trích ly tinh dầu bằng dung môi phụ thuộc vào bản chất của dung môi rất nhiều [38, 44, 58]. Trong sản phẩm chiết bằng dung môi ngoài tinh dầu, các thành phần khác cũng đƣợc tách ra nhƣ chất màu curcuminoid, các lipid, nhựa sáp. Vì vậy, công đoạn tinh chế phức tạp, tỷ lệ bay hơi dung môi cao.
Ngoài thu nhận tinh dầu bằng dung môi thì phƣơng pháp thu nhận tinh dầu bằng chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc là phƣơng pháp phổ biến, đơn giản có thể cơ giới hóa, thời gian ngắn.
Bảng 3. 2: Hàm lượng tinh dầu tách chiết LCHN
Phƣơng pháp
Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng tƣơi
(%)
Hàm lƣợng tinh dầu tính theo trọng lƣợng khô (%)
LCHN 100 0,93 0,025 4,5 0,01
Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n=3
Kết quả bảng 3.2 cho thấy hàm lƣợng tinh dầu thu đƣợc bằng LCHN cho hàm lƣợng tinh dầu cao hơn khi trích ly bằng dung môi.
Theo nghiên cứu của Apisariyakul và cộng sự, chiết tinh dầu nghệ vàng bằng n- hexane qua đêm thu đƣợc 3,7 % (w/w) [38]. Phan Minh Giang và cộng sự sử dụng các loại dung môi khác nhau để chiết tinh dầu nghệ và với chloroform, các tác giả thu đƣợc 0,03%(v/w) [20]. Garg và cộng sự chiết tinh dầu nghệ vàng trồng ở đồng bằng Ấn Độ bằng phƣơng pháp LCHN, lƣợng tinh dầu thu đƣợc (ml) tính theo trọng lƣợng tƣơi dao động trong khoảng 0,16-1,94%, tùy thuộc vào điều kiện trồng trọt [58]. Manzan và cộng sự chiết tinh dầu và curcumin nghệ vàng bằng phƣơng pháp cất LCHN lƣợng tinh dầu thu đƣợc dao động trong khoảng 0,2-0,45% trọng lƣợng tƣơi [44]. Usmart và cộng sự tách chiết tinh dầu nghệ vàng trồng ở phía bắc Nigeria bằng LCHN thu đƣợc 0,72% trọng lƣợng tƣơi [132]. Leela và cộng sự thu đƣợc 3,8% tinh dầu từ rhizome tính theo trọng lƣợng khô [84]. Nhƣ vậy, kết quả bảng 3.2 cho thấy lƣợng tinh dầu thu đƣợc bằng LCHN từ nghệ vàng của Việt Nam khá cao so với kết quả của các tác giả khác (0,93%).
Theo khảo sát ở Việt Nam nghệ vàng là cây dƣợc liệu đƣợc trồng phổ biến đặc biệt ở miền Bắc. Tinh dầu nghệ vàng trồng ở Hòa Bình, Thanh Hóa, KomTum... cũng đã đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học [12, 13, 17, 18]. Vì vậy việc nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của tinh dầu từ nghệ vàng trồng ở Hƣng Yên là rất khả thi góp phần làm phong phú thêm tính ứng dụng cho chi Curcuma ở Việt Nam.
Từ kết quả bảng 3.1 và 3.2, chúng tôi chọn thu nhận tinh dầu bằng phƣơng pháp LCHN và theo kết quả đề tài KC.05-07/06-10 do TS Đặng Xuân Hảo chủ nhiệm, sản xuất tinh bột nghệ với hàm lƣợng curcumin cao từ giống nghệ vàng trồng ở Hƣng Yên thì đây cũng là phƣơng pháp tận thu đƣợc hàm lƣợng tinh dầu [23].
Hình 3. 1: Quy trình tách chiết tinh dầu nghệ vàng bằng phương pháp LCHN.
3.1.2 Xác định các chỉ số hóa lý của tinh dầu nghệ vàng tách chiết bằng các phƣơng pháp khác nhau pháp khác nhau
Mỗi loại tinh dầu phụ thuộc vào phƣơng pháp tách chiết đều có những tính chất cảm quan và tính chất lý hoá đặc trƣng. Dựa vào các chỉ số hóa lý có thể đánh giá đƣợc mức độ tinh khiết, nhóm chất đặc trƣng, thời gian bảo quản… Bằng phƣơng pháp phân tích hóa lý chúng tôi xác định một số chỉ tiêu kết quả ở bảng 3.3
Loại nƣớc bằng CaSO4 khan Kiểm tra chất lƣợng Nghiền Nghiền - Tỷ lệ NL/Nƣớc: 1/5 - Nhiệt độ sôi - Thời gian: 8 h. LCHN hồi lƣu Hệ thống chƣng cất LCHN.
Tinh dầu thô
Bã nghệ Nguyên liệu nghiền, d 4 mm
Sấy khô Bột Đóng gói Tinh dầu Nghệ vàng tƣơi Bột nghệ
Bảng 3. 3: Chỉ số hóa lý của tinh dầu nghệ tách chiết bằng các phương pháp khác nhau
STT Chỉ số hóa lý Tinh dầu
LCHN Chloroform n-hexane
1 Độ trong Trong Trong Trong
2 Màu sắc Vàng nhạt Vàng Vàng
3 Mùi Thơm mùi nghệ Thơm hắc Thơm hắc
4 Vị Hơi cay Hơi đắng Hơi đắng
5 Tỷ trọng d20 20 0,827 0,884 0,870 6 Góc quay cực 28 D 270,78’ 300,6’ 330,5’ 7 Chỉ số khúc xạ n20 D 1,504 1,615 1,532 8 Chỉ số axit 2,68 3,07 3,26 9 Chỉ số ester 3,642 4,25 4,11
Kết quả bảng 3.3 cho thấy tỉ trọng của tinh dầu phụ thuộc vào thành phần hoá học của nó. Những tinh dầu chứa tecpen hay những hợp chất no thƣờng có tỉ trọng dƣới 0,9, những tinh dầu chứa hợp chất có oxy, vòng thơm sunfua, metric thƣờng có tỉ trọng lớn hơn. Tỷ trọng của tinh dầu nghệ vàng khai thác bằng LCHN và dung môi đều ở mức nhỏ hơn 0,9 điều đó chứng tỏ tinh dầu chứa tecpen hay các hợp chất no
Chỉ số khúc xạ cho biết mức độ tinh khiết và các cấu tử chứa trong tinh dầu là no hay không no hoặc chứa nhân thơm. Nếu trong tinh dầu có nhiều cấu tử chứa liên kết đôi thì chỉ số khúc xạ cao. Bảng 3.3 cho thấy chỉ số khúc xạ của tinh dầu nghệ vàng đều cao hơn 1,5 trong khi tinh dầu nghệ vàng tách bằng các phƣơng pháp khác nhau đều chứa nhiều liên kết đôi. Đặt biệt trong dịch chiết bằng dung môi chloroform chỉ số này cao hơn, cho thấy tinh dầu sau trích ly lẫn nhiều tạp chất.
Góc quay cực α của tinh dầu thể hiện khả năng hòa tan tinh dầu trong dung môi hữu cơ, nếu góc quay cực càng lớn thì tinh dầu có thể hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ phân cực và ngƣợc lại góc quay cực càng nhỏ thì tinh dầu hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ không phân cực. Với kết quả thu đƣợc cho thấy tinh dầu nghệ tan ít trong dung môi phân cực khi tách bằng LCHN nhƣng lại tan tốt hơn khi tách bằng dung môi n-hexane do hòa tan nhiều chất khác có khả năng tan trong dung môi phân cực.
Việc xác định các chỉ số hóa học có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác bảo quản, thu mua, chế biến và sử dụng tinh dầu vào các mục đích cần thiết. Qua những chỉ số đó có thể nhận biết đƣợc hàm lƣợng các nhóm hợp chất cần thiết, chất lƣợng và độ tinh khiết của
tinh dầu. Tùy thuộc vào phƣơng pháp khai thác và thời gian bảo quản tinh dầu mà chỉ số axit sẽ thay đổi. Nếu tinh dầu bảo quản lâu thì các hợp chất este bị thủy phân, các hợp chất