IV. BÀN LUẬN
4.1. Kết quả sản xuất các gam chuẩn
4.1.3. Tạo mạch thẳng ADN plasmid bằng cắt enzyme giới hạn
ADN phải ở dạng mạch thẳng để sản phẩm ARN tổng hợp có chiều dài
đồng nhất (Hình 2.2). Hiệu giá ARN tối ưu phụ thuộc vào khuôn mẫu phản
ứng phiên mã, tức là ADN mạch thẳng của giai đoạn cắt ADN mạch vòng bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) [37],[134].
Mỗi véc-tơ thường có một hoặc một vài enzyme tạo mạch thẳng mà vị
trí cắt enzyme tạo ra một khoảng tối ưu tính từ trình tự chức năng phiên mã. Với véc-tơ TOPO®pCR 2.1, enzyme tạo mạch thẳng là Hind III và kích thước ADN của mạch thẳng là 3890bp, trong khi enzyme tạo mạch thẳng của
pGEM-T Easy là SalI với kích thước 3015bp [132],[133]. Sau khi tạo mạch
thẳng, điện di kiểm tra sản phẩm để bảo đảm plasmid đã được cắt hồn tồn,
có kích thước đích như mong muốn (kích thước đích bằng tổng kích thước
của véc-tơ và sản phẩm đích), ln điện di cùng với chứng dương là plasmid
mạch vịng (khơng cắt enzyme giới hạn). Hình 3.7 cho thấy plasmid tái tổ hợp
chứa một đoạn gen mã hóa protein M của virus cúm mùa A được tạo mạch
thẳng từ plasmid mạch vòng sử dụng vec-tơ pGEM T Easy nên kích thước đích mong muốn là 3015bp + 212bp = 3227bp. Cùng phân tử nhưng mạch
trúc vòng, xoắn và siêu xoắn. Sản phẩm RFLP chỉ có một dải ADN duy nhất,
khơng có các dải phụ, điều này cho thấy phản ứng RFLP đã cắt hoàn toàn plasmid mạch vòng, đảm bảo sản phẩm của phản ứng phiên mã là đồng nhất.
Ngoài ra mạch thẳng luôn nằm giữa trọng lượng mạch vòng và mạch xoắn
của plasmid mạch vịng cho thấy đây chính là kích thước mong muốn.
Với phiên mã trực tiếp, do trình tự chức năng được gắn vào mồi nên sản phẩm ln là ADN mạch thẳng với kích thước bằng tổng chiều dài trình tự đích, chiều dài của cặp mồi, và chiều dài trình tự chức năng được cài vào mồi. Hình 3.8 cho thấy sản phẩm khuếch đại với mồi cải biên khoảng gần 200bp, chính là tổng chiều dài (191bp) đoạn gen 7 mã hóa protein M của cúm
A/H1N1pdm09 (154bp) và chiều dài của 2 cặp mồi cải biên (37bp). Sản phẩm sáng, rõ rét, khơng có dải ADN phụ. Điều này khẳng định sản phẩm đích đã
được khuếch đại với cặp mồi cải biên và khơng có các sản phẩm khơng đặc
hiệu [140-142].