Xác định hiệu giá ARN bên trong tế bào bằng real-time RT-PCR TaqMan và tối ưu điều kiện phản ứng: Thử nghiệm thăm dò được tiến hành trên tế bào Vero nuôi cấy ở tấm nhựa 24 giếng tương tự như thử nghiệm tạo đám hoại tử (Hình 2.6). Dựa vào kết quả chuẩn độ virus, cấy vắc xin mẫu
chuẩn M-0107 do POPYVAC cung cấp ở các nồng độ đặc và pha loãng bậc
10 từ 10-1 đến 10-4sau khi đã trả đông khô theo đúng quy định của nhà sản
xuất (5,5ml nước cất/lọ 10 liều), mỗi nồng độ cấy 2 giếng, mỗi tấm nhựa đều
có kèm 01 hàng chứng âm là tế bào khơng gây nhiễm virus. Chính xác sau khi cấy tại các thời điểm 24, 48, và 72 giờ, tách chiết ARN toàn phần trong tế bào bằng 3 phương pháp: i./ sử dụng trypsin tách tế bào như quy trình tách tế bào
thông thường để làm bong rời tế bào khỏi bề mặt bám, sau đó rửa sạch tế bào
bằng PBS 1/75M và ly tâm (2500 vòng/phút x 15 phút x 4oC) rồi trả lại 300μl
PBS và tách chiết ARN sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN (Qiagen), sau cùng, định lượng ARN virus sởi bằng real-time RT-PCR một bước sử dụng các đoạn mồi và đầu dò đặc hiệu sởi là Ms1131-1160F/Ms1213- 1190R/Ms1136-1187P (Bảng 2.1); ii./ sử dụng dung dịch ly giải nhanh tế bào (TpLR) 300μl/giếng và ủ ở 37oC x 4 phút để ly giải toàn bộ tế bào, sau đó
ARN được tách chiết bằng bộ sinh phẩm tách chiết ARN (Qiagen) và được định lượng bằng real-time RT-PCR như mục (i.) đã trình bày ở trên. iii./ chỉ ly giải tế bào bằng TpLR 300μl/giếng và ủ ở 37o
C x 4 phút, hỗn dịch này được
sử dụng trực tiếp làm khuôn mẫu của phản ứng real-time RT-PCR một bước như như mục (i.) đã trình bày ở trên. Sản phẩm ARN của cả 3 phương pháp
tách chiết tại các thời điểm 24, 48, và 72 giờ được giữ ở -80oC, không làm
đông-tan băng ARN quá 5 chu kỳ và được làm xét nghiệm đồng thời. Thành phần và điều kiện phản ứng giống với phản ứng real-time phát hiện cúm
A/H5N1 hoặc A/H1N1pdm09 nhưng khác về cặp mồi và đầu dò đặc hiệu. Kết
quả âm tính khi giá trị Ct xuất hiện sau chu kỳ 40, kết quả dương tính được định lượng trực tiếp nhờ gam chuẩn ngồi 101-106 bản sao/5µl khn mẫu:
Hiệu giá RNA/ 0,5ml = Số bản sao RNA/ 5µlx15x 5x độ pha lỗng 2
So sánh sự khác biệt tuyệt đối và tương quan hiệu giá hai phương pháp
qua hệ số tương quan từng cặp ở các thời điểm 24, 48, và 72 giờ để xác định
điều kiện tối ưu của kỹ thuật về nồng độ pha loãng virus, thời gian và phương
pháp tách chiết ARN.
Sau khi tối ưu độ pha loãng vắc xin khi gây nhiễm và thời gian gặt
ARN, thử nghiệm được thích ứng từ tấm nhựa 24 giếng sang 96 giếng với lượng hóa chất, sinh phẩm và thể tích virus gây nhiễm (vắc xin mẫu chuẩn M- 0107) giảm cịn ¼.
Hình 2.6. Xây dựng phương pháp xác định công hiệu vắc xin sởi bằng real-time RT-PCR.
Xác định công hiệu vắc xin sởi thành phẩm: Sau khi đã xác định mối tương quan hiệu giá của hai phương pháp và tối ưu hóa được độ pha lỗng virus, thời gian gặt ARN, phương pháp gặt ARN thì tiến hành xác định hiệu
giá 10 loạt vắc xin thành phẩm sản xuất tại POLYVAC bằng định lượng ARN virus sởi bên trong tế bào gây nhiễm bằng real-time RT-PCR TaqMan. Đồng
thời, vẫn tiến hành xác định hiệu giá PFU để bước đầu thẩm định phương
pháp.
2.3.3.4. Phương pháp phân tích
Độ tuyến tính của phương pháp sinh học được tính tốn và vẽ hình bằng phần mềm BioAssist của WHO, hệ số tương quan (R) và công thức đường thẳng tuyến tính y=ax+b của real-time được tính tốn tự động dựa vào
phần mềm của hệ thống thiết bị Applied Biosystems 7500 FAST. Độ chính
xác trong phản ứng xác định công hiệu dựa vào giá trị ngưỡng của phản ứng (Ct), kết quả định lượng dựa vào gam chuẩn ngồi 101-106 bản sao/5µl khn
mẫu và chỉ nhận giá trị nguyên dương. So sánh trung bình từng cặp của biến
liên tục sử dụng test t và giữa các cặp dựa vào phân tích INOVA một chiều.
Giá trị p<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Các số liệu thống kê khác
được tính tốn dựa trên phần mềm Excel hoặc SPSS.
2.3.3.5. Thẩm định phương pháp kiểm định công hiệu vắc xin sởi
Phương pháp kiểm định công hiệu vắc xin sởi đơn, sống giảm độc lực
sản xuất tại Việt Nam bằng định lượng ARN bên trong tế bào gây nhiễm sử
dụng kỹ thuật real-time RT-PCR một bước được thẩm định theo hướng dẫn
của WHO về thẩm định các phương pháp sinh học có tính chất định lượng
bao gồm các tiêu chí i./ Độ đúng. ii./ Độ chính xác (bao gồm độ lặp lại trong
cùng một lần làm phản ứng và độ lặp lại trung gian). iii./ Độ tương quan
chuẩn ngoài (101-106). iv./ Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng. v./
Tính đặc hiệu và Tính lựa chọn. vi./ Độ mạnh. Tiêu chí chấp nhận của phương pháp dựa theo khuyến cáo của Phịng thí nghiệm Kiểm định Quốc
gia, Viện Sức khỏe Quốc gia (National Institute of Health - NIH), Bộ Y tế
Thái Lan là độ đúng PFU so với khoảng giới hạn công hiệu công bố của nhà sản xuất (4,2-4,7 Log10/liều 0,5ml), độ chính xác phải nằm trong khoảng giới
hạn 3 độ lệch chuẩn (±3SD), tuân theo Dược điển Châu Âu (không khác biệt quá ±0,3Log10) và khuyến cáo của NIH Thái Lan (không khác biệt quá
±0,5Log10), hệ số biến thiên (Coefficient of Variation - CV) phải dưới 10% (áp dụng tiêu chí của thử nghiệm enzyme). Hệ số tương quan (R) của phản ứng real-time phải >0,97. Giới hạn định lượng phải nằm trong khoảng tuyến tính của gam chuẩn ngồi, độ mạnh phải có CV <10%, kết quả tương quan
của hai phương pháp xác định công hiệu bằng PFU và định lượng ARN dựa
theo thang phân loại 4 mức độ tương quan (0-0,25 là không tương quan; 0,26-
0,5 là tương quan lỏng lẻo; 0,51-0,75 là có tương quan; và 0,76-1,0 là tương
quan chặt chẽ). Giá trị trong khoảng [0;1] là tương quan thuận và [-1;0] là
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Sản xuất chứng dương ARN
3.1.1. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển
3.1.1.1. Khuếch đại ARN
Hình 3.1. Khuếch đại các đoạn gen cho phản ứng tạo dòng. Giếng 1, 16: thang ADN chuẩn 100bp (Promega)