Phiên mã được thực hiện nhờ enzyme phiên mã T7 và luôn kèm theo chứng phiên mã của nhà sản xuất (pGEM). Sau phiên mã, dùng enzyme RQ1 phá hủy hoàn tồn khn mẫu ADN và chỉ giữ lại ARN. Sau cùng, sản phẩm
ARN được tinh sạch bằng hóa chất theo phương pháp phenol:chloroform.
Mật độ quang học (Optical Density - OD), hệ số chuyển đổi Avogadro, kích
thước sản phẩm đích và cấu trúc ARN sẽ là những thơng số cơ sở để tính sản lượng và nồng độ sản phẩm ARN đích. Sản phẩm ARN mới được tổng hợp được pha loãng trong nước khử ion đã xử lý diethylpyrocarbonate (DEPC) và
khơng có nuclease thành các hỗn dịch chứng ARN có nồng độ mong muốn
trong một đơn vị thể tích phản ứng, được kiểm tra bằng RT-PCR có bước RT
(RT +) và khơng có bước RT (RT-). Vị trí cắt RFLP Sản phẩm ADN T7 Promotor Vị trí cắt RFLP RQ1 Sản phẩm ARN đích
Bảng 2.3. Pha hỗn dịch phiên mã [37].
Sinh phẩm Số lượng/phản ứng Chứng dương (pGEM)
Đệm phiên mã T7x2 10μl 10μl
ADN mạch thẳng 1μg 1-8μl 0μl
Chứng dương pGEM 0μl 1μl
Nước khơng có nuclease 0-7μl* 7μl
Enzyme phiên mã 2μl 2μl
Tổng số 20μl 20μl
Ghi chú: *: Cho vừa đủ tổng thể tích phản ứng là 20µl.
Phiên mã trực tiếp:
Đoạn mồi cổ điển đặc hiệu được cải biên bằng cách cài thêm tương ứng ở đầu 5’ của mồi xuôi và mồi ngược một trình tự kích thích phiên mã T7 và
poly T. Trước tiên, khuếch đại ARN nguồn bằng RT-PCR cổ điển với mồi cải
biên. Sau khi kiểm tra sản phẩm với kích thước mong muốn là tổng kích thước của sản phẩm đích khi sử dụng mồi đặc hiệu và kích thước của 2 đoạn
mồi xi và ngược thì khẳng định bằng giải trình tự gen (Hình 2.3). Sau cùng, tinh sạch sản phẩm ADN và tiến hành bước phiên mã in vitro mà khơng cần qua các bước tạo dịng và chuyển nạp vào E.coli. Phá hủy ADN khuôn mẫu và tính tốn số bản sao ARN giống như phiên mã cổ điển.