-1012 bản sao/5µl.
Ghi chú: Trục tung: ∆Rn; Trục hoành: chu kỳ khuếch đại.
1 2 3
400bp 200bp 100bp
Sau sản xuất, gam chuẩn được tinh sạch và giữ ở -80oC ở các ống ly
tâm 50ml (gốc) và 1,8ml, có nắp xốy và khơng có nuclease. Chứng dương
hoạt động được pha loãng hàng loạt ở các ống Eppendorf và giữ ở -30oC,
được đánh giá tính ổn định trong suốt thời gian nghiên cứu tại phịng thí nghiệm (03/2011 - 04/2014 với 41 lần xét nghiệm phức hợp ARN 104
bản sao
cho mỗi virus cúm mùa A, hRSV, hMPV và 105 bản sao cho virus cúm B; 18
lần xét nghiệm cho mỗi gam chuẩn của thử nghiệm real-time phát hiện cúm) và tại khoa virus, Viện Pasteur Nha Trang (năm 2012 với 18 lần xét nghiệm
phức hợp ARN 104 bản sao cho mỗi virus cúm mùa A, hRSV, hMPV và 105
bản sao cho virus cúm B) (số liệu cụ thể không được chỉ ra trong đề tài nghiên cứu này). Chứng dương sau đó được sử dụng làm i./ mẫu nội kiểm ở dạng phức hợp ARN của 4 tác nhân là virus cúm mùa A, virus cúm B, hRSV và hMPV cho mục tiêu 2; ii./ gam chuẩn ngoài sởi 101-106 bản sao/5µl thể
tích khn mẫuđể định lượng cho mục tiêu 3 của đề tài.
3.2. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR
3.2.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, 336; 452; và 485 mẫu bệnh phẩm là tăm bơng
ngốy mũi và họng của bệnh nhân SARI đã được thu thập liên tục theo đúng định nghĩa ca bệnh từ 1/2009 đến hết 6/2011 (tổng số 1273 mẫu). Tỷ lệ
nam/nữ = 1,3; tuổi dao động từ 2 tháng đến 84 tuổi, trung vị là 2 tuổi và trẻ <5 tuổi chiếm 63,3%.
3.2.2. Đặc điểm trường hợp tử vong do cúm
Trong tổng số 1273 bệnh nhân SARI, có một trường hợp nam, 70 tuổi
tử vong năm 2011 (chiếm 0,08% các trường hợp dương tính) và chẩn đoán
lâm sàng là nhiễm cúm nhưng không xác định là cúm A/H1N1pdm09 hay cúm gia cầm A/H5N1. Bệnh phẩm của trường hợp này đã được xét nghiệm
đồng thời để phát hiện gen M và HA virus cúm A/H1N1pdm09 và cúm gia cầm A/H5N1. Kết quả dương tính với cúm A/H1N1pdm09. Ca bệnh tử vong không đồng nhiễm với 18 tác nhân virus khác và kết quả khuếch đại gen nội
chuẩn (house keeping gene) dương tính.
3.2.3. Ứng dụng chứng dương trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
Các chứng dương, trong đó có chứng dương của nghiên cứu này được
sử dụng làm mẫu nội kiểm cho các thử nghiệm RT-PCR đa mồi phát hiện
ARN của 18 tác nhân virus gây bệnh đường hô hấp của dự án SISEA qua 5 phản ứng: phản ứng 1 phát hiện virus cúm mùa A (A/H3N2 và A/H1N1), hRSV, cúm B, và hMPV; phản ứng 2 phát hiện 4 parainfluenza (hPIV 1-4); phản ứng 3 phát hiện các virus rhino (HRV), cúm C và SARS; phản ứng 4 phát hiện các virus corona (hCoV) gồm các chủng OC43, 229E, HKU1, và NL63; và phản ứng 5 phát hiện virus adeno (hAdV) và virus boca (hBoV). Ngoài ra các phản ứng RT-PCR đơn mồi phát hiện virus cúm
A/H1N1pdm09). Trong số 1273 mẫu bệnh phẩm, có 818 mẫu dương tính với
bất cứ loại virus nào trong số này và chiếm 64,3%. Nghiên cứu này chỉ đề cập đến số liệu của cúm (nhưng không bao gồm chi tiết số liệu cúm C).
Tỷ lệ nhiễm cúm chung và nhiễm cúm từng năm được trình bày ở Bảng
3.3. Tỷ lệ dương tính trung bình của virus cúm mùa A (A/H3N2, A/H1N1),
cúm B, và cúm A/H1N1pdm09 tương ứng là 1,9%; 6,4%; và 10,4% trong suốt 2,5 năm nghiên cứu. Nghiên cứu này có tỷ lệ dương tính với cúm C là 0,5%, không phát hiện được trường hợp nào dương tính với cúm gia cầm
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm cúm ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương, 2009-2011
Tác nhân 2009 2010 2011 2009-2011
Cúm mùa A 14 (4,2%) 2 (0,4%) 8 (1,6%) 24 (1,9%)
Cúm B 23 (6,8%) 30 (6,6%) 28 (5,8%) 81 (6,4%)
A/H1N1pdm09 81 (24,1%) 1 (0,2%) 51 (10,5%) 133 (10,4%)
Virus khác 6 mẫu (0,5%) là virus cúm C 580 (45,6%)
Âm tính 455 (35,7%)
Tổng số 336 452 485 1273 (100%)