Hydrogel trên cơ sở Gelatin

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.3. Hydrogel trên cơ sở Gelatin

Ge là một loại polymer tự nhiên thu được bằng cách thủy phân một phần collagen như da cá, mô của khớp nối, xương động vật,… thường được ứng dụng cho dược phẩm và y tế do tính phân hủy sinh học và tương thích sinh học của nó trong mơi trường sinh lý. Thành phần acid amine gần đúng của Ge như sau: tyrosine < 0,5%, methionine và histidine < 1%, 1% hydroxylysine, 1% isoleucine, 2% threonine, 2% phenylalamine, 2% valine, 3% leucine, 4% serine, 4% lysine, 6%

aspartic, 8% arginine, 9% alanine, 10% acid glutamic, 12% hydroxyproline, 12% proline, 21% glycine [6].

Hình 1.26. Cấu trúc của Ge [6]

Ge trương nở khi được cho vào nước, hấp thụ một thể tích nước bằng 5 – 10 lần thể tích của bản thân nó. Khi được gia nhiệt đến nhiệt độ cao hơn điểm tan chảy, Ge sẽ trương nở hòa tan và tạo thành gel khi được làm nguội. Q trình chuyển đởi giữa dạng dung dịch và dạng gel có tính tḥn nghịch. Tuy Ge có thể tạo gel khơng cần phối hợp với chất nào khác. Nhưng tính chất gel của Ge phụ thuộc rất lớn vào nồng độ, nhiệt độ, pH và thời gian. Khi nồng độ càng tăng và nhiệt độ càng cao thì độ nở của Ge càng lớn. Nồng độ của Gel càng tăng và độ nở càng cao thì độ nhớt của gel càng lớn. Nhiệt độ và thời gian gia nhiệt càng cao thì độ cứng của gel càng giảm. pH càng thấp thì độ cứng của gel càng giảm, cùng pH nếu thời gian gia nhiệt càng dài thì độ cứng của gel càng giảm nhanh [6].

Phân tử sinh học Ge ngày càng được sử dụng nhiều hơn trong y sinh (ngoài việc sử dụng truyền thống trong thực phẩm và mỹ phẩm. Những ưu điểm hấp dẫn của Ge giúp nó có nhiều lợi thế cho các ứng dụng dược phẩm y sinh. Thứ nhất, nó rẻ và sẵn có, có tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học cao. Thứ hai, là một sản phẩm biến tính, Ge ít kháng nguyên hơn nhiều so với collagen. Thứ ba, các chuỗi Ge chứa nhiều mô típ như chuỗi arginine–glycine–aspartic (RGD) điều chỉnh độ kết dính của tế bào, do đó cải thiện tính sinh học cuối cùng so với các polymer thiếu các vị trí nhận dạng tế bào này. Thứ tư, các nhóm chức năng đa dạng và dễ tiếp cận của nó cho phép biến tính hóa học, chẳng hạn như kết hợp với các liên kết ngang và phối tử trúng đích, cho phép tiếp tục phát triển các phương tiện vận chuyển thuốc trúng đích [26].

Năm 2007, Kunal Pal cùng các đồng nghiệp đã nghiên cứu thiết kế và phát triển hydrogel bằng polyvinyl alcohol (PVA) với Ge. Các màng được đặc trưng bởi quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), nhiễu xạ tia X (XRD) và phân tích nhiệt lượng quét vi sai. Độ nhớt của sản phẩm ester hóa (dưới dạng dung dịch) được so sánh với hỡn hợp PVA và Ge có cùng thành phần. Các tính chất cơ học của hydrogel được đặc trưng bởi các thử nghiệm độ kéo. Khả năng trương và tính tương thích của màng cũng được đánh giá. Hệ số khuếch tán của salicylic acid (SA), khi ngăn thụ thể chứa dung dịch Ringer’s, qua màng được xác định.. Phổ FT-IR của màng cho thấy q trình ester hóa hồn tồn các nhóm carboxylic tự do của gelatin. Các nghiên cứu XRD chỉ ra rằng độ kết tinh của màng chủ yếu là do Ge. Việc so sánh độ nhớt chỉ ra sự gia tăng mật độ phân đoạn trong phân tử. Màng có đủ độ bền và khả năng giữ nước. Tính tương hợp cho thấy hydrogel có thể được dùng làm băng vết thương và như một hệ thống phân phối thuốc cấy ghép. Hệ số khuếch tán của SA qua màng được tìm thấy là 1,32×10−5 cm2/s. Các kết quả thử nghiệm chỉ ra rằng hydrogel có thể được sử dụng cho các ứng dụng y sinh khác nhau [27].

Năm 2009, Shinji Sakai cùng đờng nghiệp đã dùng một nhóm hydroxyl phenolic (Ph) kết hợp vào Ge, sử dụng chất hoạt hóa carbodiimide trong pha nước, để thu được các vật liệu dựa trên protein có thể tiêm và tiêm in situ cho các ứng dụng kỹ thuật mô và phân phối thuốc. Sơ đờ tởng hợp để hình thành Ge–Ph sử dụng EDC và NHS được mô tả trong Hình 1.26. Bằng cách này, thu được các dẫn xuất gelatin có thể tạo gel thông qua phản ứng xúc tác peroxidase. Các gel Ge liên kết chéo ngang enzyme không tan chảy ở 37oC và cho thấy khả năng phân hủy protein có thể điều chỉnh được. Thời gian cần thiết cho q trình gel hóa giảm khi hàm lượng nhóm phenol hydroxyl (Ph) tăng, nờng độ peroxidase và nồng độ H2O2 giảm. Khả năng chống nén gel cũng phụ thuộc vào hàm lượng của các nhóm Ph, với gel có hàm lượng nhóm Ph thấp nhất cho thấy khả năng chống nén lớn nhất. Họ đã bao bọc các tế bào nguyên bào sợi L929 trong gel Ge trong các điều kiện gây ra sự gel hóa trong khoảng 10s. Ảnh chụp dung dịch Ge 3% (w/v) và Ge–Ph (a) trước và (b) sau khi thêm HRP và H2O2 lần lượt ở 1 đơn vị/ml và 10 mM được thể hiện trong Hình 1.27. Các tế bào được bao bọc cho thấy khả năng sống sót khoảng 95%. Ngồi ra, các tế bào L929 được phát triển trên gel cho thấy cấu hình tăng trưởng giống như các tế bào được gieo trên đĩa phủ Ge khơng biến tính. Các thí nghiệm tiêm dưới da trên động vật gặm nhấm đã chứng minh thành cơng trong việc hình thành gel in situ [28].

Hình 1.27. Sơ đờ tởng hợp để hình thành Ge–Ph sử dụng EDC và NHS [28]

Hình 1.28. Ảnh chụp dung dịch Ge 3% (w/v) và Ge–Ph (a) trước và (b) sau khi

thêm HRP và H2O2 lần lượt ở 1 đơn vị/mL và 10 mM. Các hủ bi ở (b) được ủ trong 2 ngày ở 37oC [28]

Năm 2016, Trinh H. T. N. đã tổng hợp hydrogel nhạy nhiệt từ Ge –pluronic

F127 thông qua việc ghép pluronic F127 đã được hoạt hóa và Ge. Curcumin được điều chế dạng nano trong môi trường phân tán là hydrogel Ge –pluronic F127 dưới tác dụng của sóng siêu âm để cải thiện tính tan tốt trong nước của curcumin và tạo ra hiệu quả cộng hợp dẫn truyền curcumin, góp phần tăng nhanh quá trình chữa lành vết thương. Cấu trúc của hydrogel được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H– NMR, đặc tính nhạy nhiệt của hydrogel được xác định bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm (inversion tube) và nhiệt quét vi sai (DSC). Hydrogel tởng hợp có khả năng chuyển đởi trạng thái sol–gel theo nhiệt độ, khi ở nhiệt độ thấp hydrogel Ge – pluronic F127 sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng khi nâng nhiệt độ lên 35oC (gần nhiệt độ cơ

thể) sẽ chuyển thành màng gel. Kích thước hạt nano curcumin trong hydrogel được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và tán xạ ánh sáng động học (DLS) cho thấy hạt nano phân bố từ 7 đến 285 nm tùy hàm lượng curcumin sử dụng. Khả năng mang nhả chậm nano curcumin được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến UV–Vis, kết quả cho thấy hệ gel có khả mang nhả chậm nano curcumin hiệu quả. Tính chất nhạy nhiệt của hydrogel Ge –pluronic F127 không thay đổi khi tải thêm hạt nano curcumin. Trong nghiên cứu in vitro cho thấy rằng ở khoảng nờng độ nanocurcumin thích hợp hệ gel composite hỡ trợ tốt cho sự tăng sinh nguyên bào sợi. Có thể kết luận rằng hydrogel Ge–pluronic F127 nhạy nhiệt có khả năng mang nhả chậm nano curcumin và có tiềm năng ứng dụng trong việc chữa lành vết thương [29].

1.4. Cơ sở, mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài 1.4.1. Cơ sở của đề tài

Cấu trúc của HRP bao gồm một tâm sắt (hay còn được gọi là tâm hoạt tính), HRP có được khả năng oxy hoá và hoạt tính xúc tác là nhờ vào tâm sắt này. Ngoài ra, trong cấu trúc còn có các thành phần peptide và đặc biệt là một cầu nối phối trí imidazole giúp HRP tan được trong nước và tăng hoạt tính của HRP. Tuy nhiên, HRP là một enzyme tự nhiên cho nên việc phân lập rất khó và tốn nhiều chi phí nên giá thành rất cao. Ngoài ra, nó còn không ổn định và được chứng minh là dễ dàng bị mất hoạt tính khi ở trong môi trường có nồng độ H2O2 cao [7]. Từ đó, yêu cầu đặt ra là phải tổng hợp được một loại enzyme thoả mãn hai yếu tố. Thứ nhất, phải có hoạt tính xúc tác tương tự với HRP. Thứ hai, phải có độ ổn định cao và không bị mất hoạt tính. Nhận thấy, He là một trong những hợp chất có đặc điểm cấu trúc và khả năng xúc tác tương tự với HRP. He là một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và việc sử dụng He khắc phục được các nhược điểm của HRP đã đề cập trước đó. Tuy nhiên, HRP có được sự hiệp trợ từ các thành phần peptide và cầu nối phối trí imidazole, vì vậy nó rất dễ tan trong dung dịch ở các điều kiện pH khác nhau. Còn đối với He, do tính kỵ nước của cấu trúc hydrocarbon và hoản toàn không có các thành phần peptide hay cầu nối phối trí imidazole hiệp trợ nên He chỉ tan được trong môi trường kiềm, từ đó làm giảm khả năng thay thế HRP.

Dựa trên đặc điểm cấu trúc của HRP và He, các nghiên cứu gần đây cho thấy việc biến tính He nhằm cải thiên độ hoà tan của nó trong môi trường nước trung tính đang được quan tâm. Các nghiên cứu này chủ yếu đưa các polymer hoặc protein có nguồn gốc từ thiên nhiên gắn lên He nhằm mục đích biến tính cấu trúc của He gần

giống với cấu trúc của HRP và cho kết quả vô cùng khả quan. Sản phẩm sau khi biến tính đều có khả năng hoà tan trong nước, có độ linh hoạt cao, hoạt tính xúc tác cao hơn Hemin nguyên chất và hoàn toàn có khả năng thay thế HRP.

Trong lĩnh vực y sinh thì đòi hỏi xúc tác (enzyme) phải thoả mãn các yếu tố như: không độc hại, tương thích sinh học tốt và có khả năng phân huỷ sinh học. Gelatin (Ge) là một protein tự nhiên có các đặc tính vượt trội như:

+ Dễ hoà tan trong các khoảng pH rộng

+ Tương thích sinh học và có khả năng phân huỷ sinh học + Không độc hại

+ Trong cấu trúc còn có các nhóm chức năng hoạt động nên dễ dàng biến tính hoá học

Tuy nhiên, để biến tính cấu trúc của He giống với cấu trúc của HRP thì vẫn còn thiếu một cầu nối phối trí imidazole. Cho nên trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn biến tính Hemin bằng Ge (cung cấp các thành phần peptide) và His (cung cấp cầu nối phối trí imidazole).

1.4.2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài

Mục tiêu: Giả cấu trúc của enzyme HRP bằng He biến tính bằng Ge và His. Ý nghĩa khoa học: Tạo ra một loại enzyme có hoạt tính tương tự với HRP, tuy

nhiên ổn định hơn và không bị mất hoạt tính trong môi trường có nồng độ H2O2 cao. Ngoài ra, giá thành của HRP rất cao, He lại là nguồn nguyên liệu rẻ tiền. Cho nên việc tổng hợp hệ xúc tác Ge–His–He thành công mang lại hiệu quả không chỉ về kinh tế mà còn khắc phục được các nhược điểm của HRP đã nêu ra trước đó.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hoá chất và thiết bị sử dụng trong thực nghiệm 2.1. Hoá chất và thiết bị sử dụng trong thực nghiệm

2.1.1. Hoá chất

Bảng 2.1. Danh mục các hoá chất được sử dụng

Hoá chất Nguồn gốc

Gelatin từ da heo 99 % (Ge) Merck, Đức

Histamine 99 % (His) Acros organics, Hoa Kỳ

Hemin 97 % (He) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- Carbodiimide 98 % (EDC)

Acros organics, Hoa Kỳ

N-Hydroxysuccinimide 98 % (NHS ) Acros organics, Hoa Kỳ

Hydrogen peroxide (H2O2) Acros organics, Hoa Kỳ

Hydrochloric acid (HCl) Merck, Đức

Sodium hydroxide 99 % (NaOH) Merck, Đức

Horseradish peroxidase 5 kU (HRP) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Guaiacol 99 % (GA) Acros organics, Hoa Kỳ Pyrogalol 99 % (PGL) Sigma–Aldrich, Hoa Kỳ

Monopotassium phosphate 99,5 % (KH2PO4)

Merck, Đức

Polymer Gelatin-Tyramine (Ge-Tyr) Phòng Vật liệu Hoá dược, Viện Khoa

2.1.2. Thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.2. Danh mục dụng cụ và thiết bị sử dụng

Thiết bị Nguồn

Màng thẩm tách Spectra/Por, MWCO

12-14 kD Spectrumlabs - Mỹ

Ống nghiệm nhựa dạng eppendorf có

nắp đậy (5 mL) Duran - Đức

Cân phân tích (Nhật) Phòng Vật Liệu Hóa Dược

Máy khuấy từ gia nhiệt (Mỹ) Phòng Vật Liệu Hóa Dược

Máy đánh Votex (Trung Quốc) Phòng Vật Liệu Hóa Dược

Máy đông khơ chân khơng (Nhật) Phịng Vật Liệu Hóa Dược

Bể siêu âm (Hàn Quốc) Phòng thí nghiệm FM&D

Quang phổ kế hồng ngoại biến đổi Fourier FTIR Equinox 55 Bruker

(Đức)

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP.HCM

Thiết bị quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis) (Nhật)

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP.HCM

Hệ đo kính hiển vi quang phổ tán xạ Raman XploraONE/HORIBA (Nhật)

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng TP.HCM

Thiết bị phổ 1H-NMR đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

Avance 500 (Đức)

2.2. Tổng hợp hệ xúc tác Gelatin–Histamine–Hemin 2.2.1. Tổng hợp Gelatin–Histamine

v

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp hệ trung gian Ge–His

Hịa tan hồn tồn 500 mg Ge trong 5 mL H2O ở nhiệt độ 40oC, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm 75,582 mg His vào dung dịch Ge và điều chỉnh pH 5 bằng dung dịch HCl 0,1 N. Hịa tan hỡn hợp EDC/NHS gờm 105,57 mg EDC và 78,26 mg NHS trong 5 mL H2O. Nhỏ từ từ dung dịch EDC/NHS vào dung dịch Ge–His. Phản ứng được thực hiện trong 24 h. Tiến hành thẩm tách dung dịch phản ứng bằng màng thẩm tách Spectra/Por, MWCO 12–14 kD trong ba ngày để loại bỏ hoàn toàn xúc tác và His chưa phản ứng. Dung dịch sau thẩm tách được đông khô để thu sản phẩm. Tất cả các bước trên đều được thực hiện trong môi trường kỵ sáng. Sản phẩm được xác định cấu trúc hóa học bằng 1H–NRM, FT-IR và Raman.

78,582 mg His 105,57 mg EDC 78,26 mg NHS 5 mL H2O 500 mg Ge 5 mL H2O Hệ trung gian Ge–His

1. Hoà tan hoàn toàn ở 40oC 2. Để nguội đến nhiệt độ phòng

Phản ứng trong 24h, kị sáng

Thẩm tách sản phẩm trong 3 ngày

Đông khô thu sản phẩm

2.2.2. Tổng hợp Gelatin–Histamine–Hemin

Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp hệ xúc tác Ge-His-He

Bảng 2.3. Khối lượng He tương ứng với các tỉ lệ phản ứng giữa (Ge–His)–He

(w/w)

Tỉ lệ phản ứng giữa (Ge–His)–He (w/w)

Khối lượng He tham gia phản ứng (mg)

Thể tích NaOH để hoà tan He (mL) 1 : 0,25 25 25 1 : 0,50 50 50 1 : 0,75 75 75 1 : 1,00 100 100 100 mg Ge–His trong 10 mL NaOH Hoà tan He theo

các tỉ lệ 1:0,25; 1:0,5; 1:0,75; 1:1 Hệ xúc tác Ge-His-He Thẩm tách sản phẩm trong 3 ngày

Đơng khơ thu sản phẩm

Hịa tan hoàn toàn 100 mg Ge–His trong 10 mL dung dịch NaOH 0,1 N. Hoà tan He theo các tỷ lệ phản ứng bằng dung dịch NaOH 0,1 N (Bảng 2.1). Nhỏ từ từ dung dịch He vào dung dịch Ge–His. Phản ứng được thực hiện trong môi trường kỵ sáng trong 24 h. Tiến hành thẩm tách dung dịch bằng màng thẩm tách 12–14 kD trong ba ngày để loại bỏ hoàn toàn lượng He chưa phản ứng. Dung dịch sau thẩm tách dược đông khô để thu sản phẩm. Sản phẩm được xác định cấu trúc hoá học bằng FT–IR, Raman, đánh giá hoạt lực và hoạt tính bằng UV–Vis, đánh giá khả năng tạo hydrogel.

2.2.3. Hoạt hoá Hemin trong mơi trường kiềm (Hemin–NaOH)

Hịa tan hoàn toàn 100 mg He trong 100 mL dung dịch NaOH 0,1 N. Phản ứng được thực hiện trong môi trường kỵ sáng trong 24 h. Tiến hành thẩm tách dung dịch bằng màng thẩm tách Spectra/Por, MWCO 12–14 kD trong 3 ngày để loại bỏ hoàn toàn lượng NaOH chưa phản ứng. Dung dịch sau thẩm tách dược đông khô để thu sản phẩm. Sản phẩm được đánh giá hoạt lực bằng UV–Vis và đánh giá khả năng tạo hydrogel so với hệ xúc tá Ge–His–He

2.2.4. Hiệu suất tổng hợp Gelatin–Histamine–Hemin

Tiến hành quét bước sóng hấp thụ của He ở các nờng độ khác nhau. He được hịa tan trong dung dịch đệm PBS pH 10 với các nồng độ lần lượt là 5 ppm, 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm, 15 ppm, 18 ppm và 20 ppm. Mẫu sau khi đồng nhất được cho vào cuvette thạch anh và tiến hành đo độ hấp thụ của He để xác định bước sóng mà tại đó He có độ hấp thụ thay đổi nhiều nhất – gọi bước sóng đó là Amax. Thực hiện đồng